CICIM-CU 菌种保藏规程

砂土管保藏法
砂土管保藏法是载体保藏法的一种。将培养好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液,注入灭菌的砂
土管中混合均匀，或直接将成熟孢子刮下接种于灭菌的砂土管中，使微生物细胞或孢子吸附在砂土载上，
将管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于4～6℃或室温进行保存的一种菌种保藏方法。
操作步骤如下：
1 砂土管制备
将河沙用60 目过筛，弃去大颗粒及杂质，再用80 目过筛，去掉细沙。用吸铁石吸去铁质，放入容器
中用10%盐酸浸泡，如河沙中有机物较多可用20%盐酸浸泡。24 小时后倒去盐酸，用水洗泡数次至中性，
将沙子烘干或晒干。
另取地面下40～60cm 非耕作层贫瘠且粘性较小的土，研碎，100 目过筛,水洗至中性，烘干。
将处理后的沙、土按质量比 2∶1 混合。混匀的砂土分装入保藏管中，高度为1cm 左右，旋松管盖，
121℃湿热灭菌30min。
随机抽取灭菌后的砂土管若干支，无菌条件下取少许砂土至营养肉汁培养基或PDA 培养基中。30℃培
养24 小时，检查无微生物生长后方可使用。
2 斜面培养物的制备
3 制备菌悬液
向培养好的斜面培养物中注入3～5mL 无菌水，洗下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬液，
均匀滴入砂土管中，每管0.2～0.5mL。放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入砂土管中。
4 干燥
真空抽去砂土管中水分。使用玻璃真空干燥器
5 保藏
将砂土管用火焰熔封后，存放于低温(4～6℃)干燥处保藏.每隔半年检查一次菌种存活性及纯度。或将
砂土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置干燥器内保存。
保藏时间2～10 年。
6 恢复培养
无菌条件下打开砂土管，取部分砂土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取砂土粒
于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。
7 抽样检查
每半年抽样检查一次菌种的存活情况和相关性质的稳定情况。
-70℃低温冷冻保藏
将菌种保藏在-70℃冰箱中以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。
操作步骤如下：
1 保藏管的准备
保藏管于 121℃下高压灭菌15-20 分钟，备用。
2 保护剂的选择和准备
选用30%甘油作为保护剂
3 微生物保藏物的准备
在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平
台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》（试行）），与保护剂混合均匀，分装。采用较
长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2 毫升，若是球形安瓿
管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装
于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2 小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下
操作。
4 冻结保藏
将安瓿管或塑料冻存管置于-70℃冰箱中保藏。
5 复苏方法
从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，立即取少许冻结物至适宜的培养基上进行培养。
冷冻干燥保藏
1 菌株的获取
2 基本形态的描述
形态描述包括培养特征等（详见微生物菌种资源共性描述表及细菌菌种资源描述规范）。
3 冷冻干燥保藏技术流程
3.1 标签的准备
保藏菌种的标记方法，为管外侧标记
3.2 保护剂的选择和准备
保护剂：10%脱脂乳或10%蔗糖。
（常用保护剂及制备方法见附件）
3.3 菌种的准备
3.3.1 菌液的准备
在所保藏菌种的最适培养条件下将细胞培养至对数末期，进行纯度检查后与保护剂混合均匀，分装。
纯度检查参见《微生物菌种纯度检测技术规程》。
3.3.2 用斜面培养物制备菌液
取 1～2ml 保护剂，加到试管斜面培养物上，用较长的滴管轻轻涂擦斜面，制备均匀的细胞悬液，注
意不宜泡沫过多或刺挖琼脂。然后尽快分装到试管中。
3.3.3 用液体培养物制备菌液
离心收集液体培养物中的菌体，弃去上清液，加入保护剂（每毫升培养物加1～2ml）。将培养物与
保护剂混匀，分装试管。
3.4 预冻
将菌种放入－70℃冰箱预冻。预冻速度控制在每分钟下降1℃，使样品冻结到－35℃～－40℃。
3.5 冷冻干燥
采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。
将预冻后的样品迅速置于已充分预冷地冷冻干燥机样品舱内，关闭放气阀，打开真空泵开始冷冻干燥，
接近干燥完成时，适当升温（按冷冻干燥机地具体要求进行操作），确认冷冻干燥完毕后，缓慢打开放气
阀，取出样品安瓿管置于干燥器内，备用。冷冻干燥时间一般为8～20h。
判断冷冻干燥已完成的指标：
－安瓿管内冻干物呈酥松块状或松散片状。
－真空度接近空载时的最高值。
－冷冻干燥机显示的样品温度与舱内温度接近
－蒸馏水对照管中的水分已完全挥发掉或 1％～2％氯化钴的对照管已呈深蓝色。
3.6 保藏
将试管内菌体装入菌种保藏管（制备方法见示范），低温避光保藏。
4 质量检查
保藏半年后随机抽取 10％保藏物，检查其存活率。
附件：常用保护剂及制备方法
1 常用保护剂类型及种类
1.1 酸性化合物
谷氨酸、天门冬氨酸、苹果酸等
1.2 中性化合物
葡萄糖、乳糖、蔗糖、棉子糖、山梨醇、肌醇等
1.3 高分子物质及其分解物
白蛋白、明胶、各种胨、藻类等
1.4 天然混合物
脱脂乳、血清等
1.5 其它
抗坏血酸、羟胺等
2 保护剂的制备
2.1 脱脂乳的准备
2.1.1 直接采用牛奶作为保护剂时，一般采用离心法去除上层油脂，分装后用高压法灭菌，高压法一般在
116℃灭菌20min，取出后置于37℃保温箱中培养24h 做无菌检验，检验无菌后置4℃冰箱中备用。
2.1.2 将脱脂奶粉溶于蒸馏水，浓度为20％（W/V），然后116℃高温灭菌15～20min。灭菌后于37
℃培养24h，检查是否灭菌彻底，检验无菌后置4℃冰箱备用。
2.1.3
江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心
2006 年8 月29 日

(责任编辑：大汉昆仑王)