化学诱变染色体加倍及其鉴定

一、目的
学习应用秋水仙碱诱变园艺植物染色体加倍的操作技术，以及掌握染色体倍性鉴定的常用方法。

二、材料和设备
黄瓜种子以及幼苗；秋水仙碱、二甲基亚矾（DMSO）、聚乙二醇（PEG）；蒸馏水，小滴管，50ml量筒，100ml容量瓶，卷尺、放大镜等。

三、说明
应用化学诱变剂诱导植物产生变异，进行选择育种的方法是化学诱变育种。化学诱变育种分为两类，一类是诱导产生多倍体，常用的 试剂 是秋水仙碱（Colchicine）；另一类是诱发基因突变或染色体断裂，如甲基磺酸乙酯等烷化剂。前者的应用较多、较广泛。
秋水仙碱是从百合科植物秋水仙中提取出来的植物碱，极毒，易溶于冷水和酒精中。用于园艺植物诱变育种的秋水仙碱的有效浓为0.1%～1%，以0.2%最有效。秋水仙碱诱变是通过阻断纺锤体的正常形成，使染色体不能分离而导致加倍。由于有效诱变只发生在细胞分裂状态活跃的细胞、组织，所以常用萌动或萌发的种子、幼苗或生长旺盛的茎尖作为诱变材料。二甲基亚矾（DMSO）具有改善细胞膜的透性，可以促进植物对秋水仙的吸收；聚乙二醇（PEG）可以提高细胞的渗透压，利于细胞吸收秋水仙，因此，它们常被用作秋水仙诱变的增效剂。

四、方法及步骤
1、药剂配制
可以先用少量酒精溶解秋水仙粉剂，然后定容到所需的浓度；或直接用冷的 蒸馏 水配制。实验设计的浓度为0.2%和0.5%。秋水仙羊毛酯剂，不同浓度的秋水仙水溶液3～4，羊毛脂6，充分搅匀，到看不见游离的水溶液为止。
2、诱变
①滴苗：在两片真叶刚吐出（两叶一心）时，分别用0.2%的秋水仙、0.2%秋水仙+1.5%DMSO、0.5%秋水仙、0.5%秋水仙+1.5%DMSO每天8：00和18：00滴生长点。为了减少秋水仙滴落和蒸发，可用脱脂棉置于生长点上，并在滴后遮盖遮阳网。连续处理5天。20天后，统计成活株和变异株。每种处理至少50株。
②浸种：用0.2%、0.5%、0.2%秋水仙+1.5%DMSO和0.5%秋水仙+1.5%DMSO的秋水仙碱分别浸渍（用湿纱布包裹种子）已经催芽尚未露白的种子6hr、12hr和24hr。每种处理至少50株。然后播种在营养钵中。1周后统计出苗株和变异株。
③四倍体的鉴定：在变异株中鉴定。本实验以间接鉴定为主，直接鉴定为辅。间接鉴定是与二倍体植株相比，同一基因型的四倍体特征如下：生长缓慢；叶片肥厚、色深，叶片较宽或较大，有皱折；茎较粗壮，节间变短；花冠明显增大，花色较重。在显微镜下观察比较变异株和对照株的气孔数目和大小，以及花粉粒的形态。四倍体植株的气孔，通常数目变少，但气孔变大；出现畸形花粉粒和4个萌发孔的花粉粒。果实结籽率低。直接鉴定是由1～2位同学利用卷须观察体细胞染色体数目，确证是否是2n=28。
五、作业
1） 秋水仙处理获得的变异株是否都是四倍体，为什么？
2） 影响秋水仙碱加倍染色体效果的因素有哪些？
3） 总体比较滴苗处理和浸种处理的诱变效果，并对结果予以解释说明。
表4-1 不同诱变效果的比较