禽霍乱(禽巴氏杆菌病)诊断技术

1．本次实验的目的和要求
（1）观察家禽巴氏杆菌病的临诊表现和病理解剖变化
   （2）掌握禽巴氏杆菌病的微生物学诊断方法
2．实验内容或原理
根据典型症状和病变，以及在显微镜下检查组织涂片发现的两极染色的杆菌，可初步诊断本病。但确诊应依靠病原分离鉴定，病原分离鉴定原理为革兰氏染色法。
3．需用的 仪器 或 试剂 等
动物：鸡、小白鼠
器材：外科镊子、外科剪、灭菌纱布、载玻片、糖发酵管等。
药品：草酸铵结晶紫、革兰氏碘、碳酸复红、瑞特氏染液、美蓝染液、棉拭子、接种环、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘露醇、鼠李糖、戊醛糖、纤维二糖、绵子糖、菊糖、赤藓糖、戊五醇、M—肌醇、水杨苷。胰蛋白酶、L-胱胺酸、琼脂粉、酚红。
4．实验步骤
一、临床症状和病理变化
⒈ 症状
（1）急性症状:描述
    （2）慢性症状:描述
⒉ 病理变化:描述
二 、微生物学诊断
⒈ 抹片的制备
    用镊子夹持病变组织肝或脾，然后以灭菌剪刀剪取小块，夹出后将其新鲜切面在载玻片上压印或涂抹成薄层；若取血液，用灭菌剪刀剪开心脏进行蘸取或剪取凝血块，用新鲜切面在载玻片上压印或涂抹成薄层。自然干燥。将干燥好的抹片，涂抹面向上，以其背面在酒精火焰上来回通过数次，略作加热进行固定。
⒉ 革兰氏染色法
    固定好的抹片上滴加草酸铵结晶紫色液，染色2min→水洗+加革兰氏碘溶液于抹片上媒染2min→水洗→加95％酒精于抹片上脱色1min→水洗→加稀释碳酸复红复染30s→水洗→吸干→镜检。巴氏杆菌为革兰氏阴性球杆菌或短杆菌，单个或成对存在，常有荚膜。
⒊ 其他染色法
    甲醇固定，瑞特氏或美蓝染色呈两极浓染的菌体。
⒋ 病原分离
（1）病料的采集：最急性和急性病例可采集死亡禽只的肝、脾、心血；慢性病例一般采集局部病灶组织；对不新鲜或已被污染的样品，可自骨髓中采取病料。采病料时用烧红的刀片烧烙组织，而后用灭菌棉拭子或接种环通过烧烙表面插入组织或心血内取样。如果为活禽，可通过鼻孔挤出粘液，或将棉拭子插入鼻裂中取样。
（2）培养基制备：马丁琼脂培养基（本实验中采用该培养基）、5％鸡血清葡萄糖淀粉琼脂、鲜血琼脂培养基。
（3）动物接种：如果病料污染严重，则可将0.2mL碾碎的病料，经皮下或腹腔内接种家兔、小鼠或易感鸡，接种动物在24h～48h内死亡，可以从肝脏、心血中分离到巴氏杆菌。
（4）培养：将病料接种于马丁琼脂培养基在35℃～37℃下培养，经18h～24h培养后菌落直径为1mm～3mm，菌落呈散在、圆形，表面凸起呈奶滴状。