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        EAC玫瑰花环试验

        互联网

        2586

        原理

        B淋巴细胞表面具有补体C 3 受体,红细胞可与相应的抗体(溶血素)结合形成抗原抗体复合物(EA),以红细胞作为指示细胞,通过补体传统途径活化补体,而产生活化的C 3 ,然后与活化的C 3 结合形成花环,以供计数B淋巴细胞。

         

         

        材料与 试剂

        1.鸡红细胞悬液的制备 由于绵羊红细胞易与T淋巴细胞形成E—玫瑰花环,易造成混淆,所以一般在检测B淋巴细胞时,采用鸡红细胞。从鸡翼下静脉采血,用肝素抗凝,以Hank’s洗涤2次备用。

        2.抗鸡红细胞抗体的制备 选 2kg ~ 3kg 的健康家兔,以Hank’s液洗过的压积红细胞进行免疫,每日背部皮下注射1次,共注5次,注射量为0.5 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml、2.5ml。第六次改用静脉注射50%压积红细胞悬液1ml,一日一次,连注3天。末次注射后7天试血,测定红细胞的凝集效价,以出现“ ”的最高抗血清稀释度判定为血凝效价。效价达1:2 000以上者为合格。应用时采用凝集价的1/2(亚凝集价)作为抗血清的稀释度(即1:4 000)。

         

         

        溶血素的效价测定

        试验组

        对照组

        管号

        1

        2

        3

        4

        5

        6

        7

        8

        溶血素稀释倍数

        10

        10 2

        10 3

        2×10 3

        3×10 3

        4×10 3

        5×10 3

         

         

        1 %红细胞量(ml)

        0.1

        0.1

        0.1

        0.1

        0.1

        0.1

        0.1

         

         

        溶血素量(ml)

        0.1

        0.1

        0.1

        0.1

        0.1

        0.1

        0.1

        0.1

        0.9%盐水(ml)

        0.1

        0.1

        0.1

        0.1

        0.1

        0.1

        0.1

        0.1

        混匀, 37℃ 感作1h

        结果判定

         

         

         

         

        -

        -

        -

        -

        3.补体 当日采集豚鼠混合血清,用Hank’s液稀释成1︰100,置 4℃ 保存备用。

        4.无Ca 2 、Mg 2 pH7.2的Hank’s液

        5.姬姆萨染液

        6.1%戊二醛溶液

         

         

        操作方法

        1.分离淋巴细胞,制成约2.5×10 6 个/ml悬液。

        2.EAC悬液的制备 取4%鸡红细胞2ml于 试管 中,加入1︰4 000的鸡溶血素2ml,混匀,置 37℃ 水浴 15min,取出后离心,用Hank’s液洗涤2次,再用Hank’s液恢复至4%红细胞2ml,加入等量的1︰100稀释补体,混匀,再放置 37℃ 水浴 15min取出,用Hank’s液洗涤2次,配成4%EAC细胞悬液。

        3.取淋巴细胞悬液0.2ml,加入4%EAC细胞悬液0.2ml,混匀,室温或 20℃ 作用30min。1 000r/min离心5min,吸弃过多的上清液,放入 4℃ 2h~4h。

        4.取出后,将沉淀轻轻摇起,加1%戊二醛0.1ml,混匀后置 4℃ 固定30min。

        5.以悬液制片,自然干燥,滴加姬姆萨液染2min,加自来水继续放置15min,冲洗,将玻片置95%酒精缸脱色15sec~30sec(以脱成浅紫蓝色为度),再置盐酸液缸(按1%HCl 1份与自来水2份)脱色(呈淡兰略带红色为度)10sec左右,取出冲洗,干后镜检。

         

         

        结果判定

        凡一个淋巴细胞结合3个以上鸡红细胞即为EAC花环形成阳性细胞。共计数200个淋巴细胞,计算花环形成率。

         

         

        注意事项

        1.加入淋巴细胞与鸡红细胞的比例一般以1︰40为宜(1︰30~1︰50),淋巴细胞过少,花环形成率明显减少。

        2.淋巴细胞、红细胞、补体均应新鲜,否则花环形成率明显下降。

        3.据认为小鼠补体比豚鼠补体更为好,小鼠 血清 中胶固素活化因子(KAF)含量较多,可使大部分C 3 裂解而不易引起溶血

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