蛋白质DNS分析法DNS—Cl(膜层析技术)
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一、实验目的
1.掌握DNS 分析法测定氨基酸的原理与方法。
2.进一步熟悉薄膜层析的操作。
二、实验原理
荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯即DNS—Cl(Dansyl—Cl)，能与所有氨基酸的氨基结合，生成荧光物质DNS—氨基酸。DNS—Cl 也能与蛋白质或多肽的游离氨基结合，生成DNS—蛋白质或DNS—肽，经酸水解后释放出DNS—氨基酸。
各种DNS—氨基酸与聚酰胺薄膜形成氢键的能力个同，即在溶剂与聚酰胺薄膜之间的分配系数不一样，故可用聚酰胺薄膜层析分离各种DNS—氨基酸。DNS—氨基酸在360nm 或280nm 波长的紫外光照射下，发出黄色荧光，很方便进行检测。
蛋白质和多肽经酸水解后，肽键断裂，生成游离氨基酸，所有氨基酸都能与DNS—Cl 反应。所以DNS—Cl 法可用于蛋白质或多肽氨基酸组成的微量分析。
在pH 值过高的情况下，DNS—Cl 会发生水解生成副产物DNS—NH 2 ，DNS—OH 和DNS—Cl在紫外灯下产生蓝色荧光，可以与DNS—Cl 的黄色荧光区分开来。
三、 仪器 、原料和试剂
仪器
层析缸、聚酰胺薄膜、电吹风、紫外灯、毛细管、真空干燥箱、具塞磨口试管、水浴锅、水解管(硬质玻璃)等。
原料
蛋白或多肽样品(如胰岛素)
试剂
1. 各种层析纯标准氨基酸
2. DNS—Cl 丙酮溶液：称取250mgDNS—Cl 溶于100mL 丙酮中，贮于棕色瓶中，置冰箱保存，一个月内稳定
3. 三乙胺(重蒸)
4. 0.2mol/LNaHCO3溶液
5. 5.7mol/L 恒沸盐酸
6. 展开溶液I： 88％甲酸：水＝1.5:100(V/V)
7. 展开溶液Ⅱ： 苯:冰醋酸＝9:L1(V/V)
8. 展开溶液Ⅲ： 乙酸乙酯：甲醇：冰醋酸＝20:1:1(v/v/v)
9. 展开溶液Ⅳ： 0.05mol/L 磷酸三钠溶液:乙醇＝3:l(V/V)
10. 丙酮
四、操作步骤
1.标准氨基酸的DNS 化
分别称取2—3moL 的层析纯标准氨基酸以及样品氨基酸，溶于0.5mL0.2 mol/L 的NaHCO 3 溶液中。各取0.1mL 于有玻璃塞的 试管 中，加入0.1mLDNS—C1丙酮溶液。检查pH，必要时用三乙胺调pH 至9.0～9.5，于室温(20℃左右)放置2~4h，用无离子水稀释10倍，存于暗处备用。也可用商品DNS
—氨基酸直接使用。
2.DNS—蛋白质的制备与水解
称取0.5mg 蛋白样品置具塞 试管 中，用少量 蒸馏 水溶解，加入0.5mL0.2 mol/L 的NaHCO3溶液，再加入0.5mLDNS—C1丙酮溶液。三乙胺调pH 至9.0～9.5，于室温(20℃左右)放置2～4h。反应完毕，真空抽去丙酮，用5.7mol/L 恒沸盐酸转移至水解管，抽真空封管，110℃水解18～24hr。开管后抽去盐酸，加少量 蒸馏 水，再抽干，重复2～3次除尽盐酸，得样品1。临用前加几滴丙酮，进行层析。
3.蛋白质的水解及DNS—水解 氨基酸 液的制备
取蛋白样品1～2mg 于水解管，加5.7mol/L 恒沸盐酸50μL，110℃水解18～24hr。开管后抽去盐酸，加少量蒸馏水，再抽干，重复2～3次除尽盐酸。向水解管内加入0.2 mol/L 的NaHCO3溶液50μL，再加入50μLDNS—C1丙酮溶液，三乙胺调pH 至9.0～9.5，于室温(20℃左右)放置2—4h。反应完毕，真空抽去丙酮，加20μL 甲醇溶解，得样品2，点样层析。
4.聚酰胺薄膜的准备
将聚酰胺薄膜剪成7cm×7cm 的方块，在距边0.5cm 处画互为垂直的两条单线、交叉点为原点。若只做单向层析，则只画一条单线，在基线上每隔1cm 画一点样点。
5.点样
用微量注射器或毛细管取样1和样2，分别点在不同位置上，点样直径应小于2mm。若多次点样，则点一次，吹干一次。
6.展开
将点好样的聚酰胺薄膜卷成圆筒形，样品侧在筒内，箍以线圈固定。放在小层析槽内(可在小干燥器内置一培养皿代替)，槽内(培养皿)放入5～10mL 展开溶液Ⅰ进行展开，以溶剂前沿到达距顶端0.5cnm 左右为止(约20分钟)；取出膜片，吹干。
进行双向层析时，在第一相层析完毕且完全吹干后(有时需晾过夜，才能允分吹干)，将聚酰胺薄膜片转90度，用展开溶液Ⅱ展开。为了区分DNS—苏氨酸或区分DNS 天冬氨酸与DNS-谷氨酸，可在溶液Ⅱ展开后，吹干，接着用溶液Ⅲ沿同一方向展开，只需展开至一半高度即可。为了区分ε-DNS—赖氨酸、α-DNs—组氨酸与DNS—精氨酸，应在溶剂Ⅱ中展开后，吹干，接着在溶液Ⅳ中沿同一方向展开。
7.DNS— 氨基酸 的检测
展开结束后，取出薄膜，用吹风机吹干，在360nm 或280 nm 的紫外光灯下检测。DNS-氨基酸呈黄色荧光。此外还有其他颜色的杂点，如DNS—OH 显绿色荧光等。
用样品的层析谱与标准DNS—氨基酸层析谱相比较，样1可鉴别蛋白样品游离氨基酸种类，样2可鉴别蛋白样品的氨基酸组成种类。
1.掌握DNS 分析法测定氨基酸的原理与方法。
2.进一步熟悉薄膜层析的操作。
二、实验原理
荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯即DNS—Cl(Dansyl—Cl)，能与所有氨基酸的氨基结合，生成荧光物质DNS—氨基酸。DNS—Cl 也能与蛋白质或多肽的游离氨基结合，生成DNS—蛋白质或DNS—肽，经酸水解后释放出DNS—氨基酸。
各种DNS—氨基酸与聚酰胺薄膜形成氢键的能力个同，即在溶剂与聚酰胺薄膜之间的分配系数不一样，故可用聚酰胺薄膜层析分离各种DNS—氨基酸。DNS—氨基酸在360nm 或280nm 波长的紫外光照射下，发出黄色荧光，很方便进行检测。
蛋白质和多肽经酸水解后，肽键断裂，生成游离氨基酸，所有氨基酸都能与DNS—Cl 反应。所以DNS—Cl 法可用于蛋白质或多肽氨基酸组成的微量分析。
在pH 值过高的情况下，DNS—Cl 会发生水解生成副产物DNS—NH 2 ，DNS—OH 和DNS—Cl在紫外灯下产生蓝色荧光，可以与DNS—Cl 的黄色荧光区分开来。
三、 仪器 、原料和试剂
仪器
层析缸、聚酰胺薄膜、电吹风、紫外灯、毛细管、真空干燥箱、具塞磨口试管、水浴锅、水解管(硬质玻璃)等。
原料
蛋白或多肽样品(如胰岛素)
试剂
1. 各种层析纯标准氨基酸
2. DNS—Cl 丙酮溶液：称取250mgDNS—Cl 溶于100mL 丙酮中，贮于棕色瓶中，置冰箱保存，一个月内稳定
3. 三乙胺(重蒸)
4. 0.2mol/LNaHCO3溶液
5. 5.7mol/L 恒沸盐酸
6. 展开溶液I： 88％甲酸：水＝1.5:100(V/V)
7. 展开溶液Ⅱ： 苯:冰醋酸＝9:L1(V/V)
8. 展开溶液Ⅲ： 乙酸乙酯：甲醇：冰醋酸＝20:1:1(v/v/v)
9. 展开溶液Ⅳ： 0.05mol/L 磷酸三钠溶液:乙醇＝3:l(V/V)
10. 丙酮
四、操作步骤
1.标准氨基酸的DNS 化
分别称取2—3moL 的层析纯标准氨基酸以及样品氨基酸，溶于0.5mL0.2 mol/L 的NaHCO 3 溶液中。各取0.1mL 于有玻璃塞的 试管 中，加入0.1mLDNS—C1丙酮溶液。检查pH，必要时用三乙胺调pH 至9.0～9.5，于室温(20℃左右)放置2~4h，用无离子水稀释10倍，存于暗处备用。也可用商品DNS
—氨基酸直接使用。
2.DNS—蛋白质的制备与水解
称取0.5mg 蛋白样品置具塞 试管 中，用少量 蒸馏 水溶解，加入0.5mL0.2 mol/L 的NaHCO3溶液，再加入0.5mLDNS—C1丙酮溶液。三乙胺调pH 至9.0～9.5，于室温(20℃左右)放置2～4h。反应完毕，真空抽去丙酮，用5.7mol/L 恒沸盐酸转移至水解管，抽真空封管，110℃水解18～24hr。开管后抽去盐酸，加少量 蒸馏 水，再抽干，重复2～3次除尽盐酸，得样品1。临用前加几滴丙酮，进行层析。
3.蛋白质的水解及DNS—水解 氨基酸 液的制备
取蛋白样品1～2mg 于水解管，加5.7mol/L 恒沸盐酸50μL，110℃水解18～24hr。开管后抽去盐酸，加少量蒸馏水，再抽干，重复2～3次除尽盐酸。向水解管内加入0.2 mol/L 的NaHCO3溶液50μL，再加入50μLDNS—C1丙酮溶液，三乙胺调pH 至9.0～9.5，于室温(20℃左右)放置2—4h。反应完毕，真空抽去丙酮，加20μL 甲醇溶解，得样品2，点样层析。
4.聚酰胺薄膜的准备
将聚酰胺薄膜剪成7cm×7cm 的方块，在距边0.5cm 处画互为垂直的两条单线、交叉点为原点。若只做单向层析，则只画一条单线，在基线上每隔1cm 画一点样点。
5.点样
用微量注射器或毛细管取样1和样2，分别点在不同位置上，点样直径应小于2mm。若多次点样，则点一次，吹干一次。
6.展开
将点好样的聚酰胺薄膜卷成圆筒形，样品侧在筒内，箍以线圈固定。放在小层析槽内(可在小干燥器内置一培养皿代替)，槽内(培养皿)放入5～10mL 展开溶液Ⅰ进行展开，以溶剂前沿到达距顶端0.5cnm 左右为止(约20分钟)；取出膜片，吹干。
进行双向层析时，在第一相层析完毕且完全吹干后(有时需晾过夜，才能允分吹干)，将聚酰胺薄膜片转90度，用展开溶液Ⅱ展开。为了区分DNS—苏氨酸或区分DNS 天冬氨酸与DNS-谷氨酸，可在溶液Ⅱ展开后，吹干，接着用溶液Ⅲ沿同一方向展开，只需展开至一半高度即可。为了区分ε-DNS—赖氨酸、α-DNs—组氨酸与DNS—精氨酸，应在溶剂Ⅱ中展开后，吹干，接着在溶液Ⅳ中沿同一方向展开。
7.DNS— 氨基酸 的检测
展开结束后，取出薄膜，用吹风机吹干，在360nm 或280 nm 的紫外光灯下检测。DNS-氨基酸呈黄色荧光。此外还有其他颜色的杂点，如DNS—OH 显绿色荧光等。
用样品的层析谱与标准DNS—氨基酸层析谱相比较，样1可鉴别蛋白样品游离氨基酸种类，样2可鉴别蛋白样品的氨基酸组成种类。
