分子生物学设计实验总结：葡激酶（sak）在大肠杆菌中的克隆表达

【实验目的及原理】

本实验是克隆金黄色葡萄球菌激酶基因（Sak）并构建其高效表达系统。葡激酶(Staphylokinase简称Sak)是金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)合成分泌的一种蛋白,具有溶血栓功能。它与纤溶酶原(Plg)结合形成1∶1的复合体,使之转变为活性纤溶酶(Pli)。在血浆中Sak能溶解纤维蛋白凝块而没有纤维蛋白原的降解,动物试验和临床试用的结果也均显示Sak是一种有着良好应用前景的抗栓药物,但迄今为止尚未正式成药。设计实验中，首先设计引物，利用PCR技术以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，扩增Sak基因。之后将其与表达载体Petblue-2连接，转入大肠杆菌中进行诱导表达。SDS-PAGE检测表达蛋白。

【 仪器 、材料与试剂】

（一） 仪器
1． 超净工作台
2． 漩涡震荡器
3． 低温离心机
4． 台式离心机
5． PCR热循环仪
6． 超声破碎仪
7． 恒温水浴器
8． 恒温摇床
9． 恒温箱
10． 琼脂糖凝胶电泳系统
11． 平板及垂直电泳槽及配套的玻璃板，胶条，梳子，恒压恒流电泳仪

（二）材料和 试剂
1． 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))
2． 无水乙醇
3． 氯仿
4． 水饱和酚
5． 异戊醇
6． 盐酸
7． Glucose
8． R-250
9． 乙酸
10． DTT
11． ddNTP mixture
12． TaqE及相应的buffer
13． HindIII BamI 相应的buffer
14． T4 DNA ligase及相应的buffer
15． 琼脂糖
16． TAE及TBE电泳缓冲液
17． 上样缓冲液及SYBR
18． DNA快速回收 试剂 盒
19． TE溶液
20． PET-BLUE-2质粒
21． 大肠杆菌JM109(含PET-BLUE-2质粒) NovaBlue DE3placI
22． LB液体培养基
23． 十二烷基硫酸钠（SDS）
24． NaOH
25． Tris
26． EDTA
27． NaAc
28． 10%Aps
29． TEMED
30． Acr/Bis(30%)
31． 10% (W/V) SDS
32． 1.5 mol/l Tris•HCl (PH=8.8)
33． 1mol/L IPTG
34． X-gal
35． 0.1 mol/L CaCl ₂
36． Amp（100μg /ml）Carb（100μg /ml）Tet（40μg /ml）Cam（100μg /ml）
37． 10×ligase buffer
38． 3mol/L KAc（PH5.2）
39． 1 mg/ml溶菌酶溶液，溶于TE缓冲液
40． 胰Rnase
41． 蛋白酶K