氨基酸的分离鉴定——纸层析法（paper chromatography）

【实验目的】 
   1.学习氨基酸纸层析法的基本原理 
   2.掌握氨基酸纸层析的操作技术 
【实验原理】 
    纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。在层析时，将样品点在距滤纸一端约2～3cm的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值（rate of flow, Rf）来表示。所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值： 




     在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。 
【器材与 试剂 】 
（一）器材 
1.层析缸 
2.点样毛细管 
3.小烧杯 
4.培养皿 
5.量筒 
6.喷雾器 
7.吹风机（或烘箱） 
8.层析滤纸（新华一号） 
9.直尺及铅笔 
(二) 试剂  
1. 扩展剂(水饱和的正丁醇和乙酸混合液)
将正丁醇和乙酸以体积比4∶1在分液漏斗中进行混合，所得混合液再按体积比5∶3与蒸馏水混合；充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。 
2. 氨基酸溶液 
0.5%赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及它们的混合液（各组份均为0.5%）。? 
3. 显色剂 
0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。 
【实验步骤】
取层析滤纸（长22㎝、宽14㎝）一张，在纸的一端距边缘2～3㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔3㎝作一记号，如右图所示。