原位杂交（in situ hybridization）

原位杂交（in situ hybridization）用特定标记的已知碱基序列核酸作为探针与组织、细胞中待检测核酸按碱基互补配对的原则在原位进行特异性结合，形成杂交体，然后用与标记物相应的监测系统，通过免疫组织化学方法在被检测核酸原位进行细胞内核酸定位。原位杂交可根据检测物而分为细胞内和组织切片原位杂交；根据其用探针及检测核酸的不同可分为DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA杂交。根据标记方法不同可分为放射性探针和非放射性探针。
其基本方法包括：固定、切片、杂交、显色等主要步骤。
(一)取材与标本固定
1． 取材　对于原位杂交所用的材料要尽可能新鲜，为了防止RNA的降解，取材要迅速，取材后要尽快固定或冷冻保存。
2． 固定　进行原位杂交的组织或细胞必须经过固定处理，固定的目的是为了①保持细胞形态原有结构；②最大限度保存细胞内的DNA或RNA的水平；③使探针易于进入细胞或组织内。
3． 固定液　常用固定液有10％甲醛、4％多聚甲醛、冰醋酸-酒精混合液、Bouin氏固定液等。这些固定液都有不同的优缺点因此要根据具体的实验对象，选择最佳的固定液。
4． 固定方法　组织标本取材后，迅速放入固定液中2～4h，取材组织大小为1cm×1cm×0.5cm，不宜太大。必要时，动物组织可进行灌流固定，然后将组织按要求取材放入20%蔗糖中，4℃过夜，次日可行冰冻切片。
(二)切片及细胞标本的制备
1． 载玻片的处理　因为原位杂交一般在载玻片上进行，所以载玻片必须保持清洁且不能有任何核酸酶的污染。一般载玻片可先经洗衣粉浸泡过夜，用流水冲洗、酸中浸泡4～8h，再用流水冲洗，双蒸水洗2～3次。在160℃烤箱中烘烤2～4h。亦可经15磅高压灭菌20min处理，可将载玻片上的核酸酶消除。
2． 组织切片与预处理
（1）冰冻切片：新鲜组织也可在取材后，直接置入液氮中迅速骤冷，冷冻切片后，4％多聚甲醛固定5～10min，也可保存在-70℃中待用。杂交前切片迅速恢复至室温并干燥，0.1mol PBS洗三次，2×SSC洗10min，滴加预杂交液室温孵育1h。
（2）石蜡切片：组织固定后，常规石蜡包埋切片，可长期保存，随时用于原位杂交。杂交前切片经①二甲苯脱蜡2次，每次10min；②纯酒精洗2次，每次5min；③空气干燥5min；④梯度酒精复洗95％，80％，70％各1min；⑤0.1 mol PBS洗3次，每次5min；⑥2×SSC洗10min；⑦滴加预杂交液于湿盒内室温孵育1h。
（3）培养细胞：每张载玻片滴加200μl浓度为1×105/m1的细胞悬浮液，空气干燥1～2min制成细胞涂片，也可直接用培养细胞盖片。上述细胞片经酒精或多聚甲醛固定5min，其余步骤同冰冻切片。
(三) 试剂 配制
配制溶液过程中均需戴手套，液体配制均用超净水，所用瓶子均经160℃烘烤4h，主要目的是去除RNA酶。
1． DEPC水　将DEPC按1‰浓度加入超净水中，充分混合后静置过夜，15~20min高压消毒，之后室温避尘存放。
2． 0.1mol PBS　pH 7.4
A液：0.1mol NaH2PO4为NaH2PO4 (MW：156.01，2H2O) 1.56g；DEPC水 100.00m1。
B液：0.1mol Na2HP04为Na2HPO4 (MW：358.14，12H2O) 17.907g；DEPC水 500.00m1。
A液：B液＝9.5∶40.5 加NaCl使其浓度达0.85％。
3． 20×SSC　为NaCl(3mol/L) 8.765g；Na3C6H50H2O7·2(0.3mol/L) 4.410g；DEPC水50.00m1。

4． 4％多聚甲醛(pH 7.4)　为多聚甲醛4g；0.1mol PBS 100m1。
5． 缓冲液
（1） 缓冲液Ⅰ(pH 7.5)　为1mol Tris-HCl 100ml；5mol NaCl 20ml；消毒超净水加至1000ml。
（2） 缓冲液Ⅱ(pH 9.5)　为1mol Tris-HCl 100ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；消毒超净水加至1000ml。
（3） 缓冲液 Ⅲ(pH 9.5)　为1mol Tris-HCl 100ml；1molEDTA 5ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；消毒超净水加至1000ml。