蛋白质分析技术

第一节 蛋白质分离纯化与鉴定的基本原理

一、蛋白质的理化性质
（一）蛋白质的两性电离

pI：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为0，此时的溶液的pH称为~。

体内大多数蛋白质：pI≈pH 5.0。在pH 7.4，大多数蛋白质解离成阴离子。少数蛋白质为碱性蛋白质（如鱼精蛋白、组蛋白）和酸性蛋白（如胃蛋白酶和丝蛋白等）。

（二）蛋白质的胶体性质

1.蛋白质：生物大分子，MW：1~100万，大小：1~100nm
2.维持蛋白质胶体稳定因素
蛋白质亲水基团→吸收水分→水化膜→防止蛋白质沉淀析出
蛋白质表面带有电荷→稳定胶体→防止蛋白质沉淀析出

（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固
1.蛋白质变性（denaturation）
2.蛋白质沉淀
（1）疏水测链暴露→蛋白质聚集→沉淀（变性）
（2）等电点或去水化膜→蛋白质沉淀（非变性）
3.复性（renaturation）与不可逆变性
（1）renaturation：蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原来的构象和功能，称为~。
（2）不可逆变性：蛋白质变性后，空间构象被严重破坏，不能恢复，称为~。
4.蛋白质的凝固作用（protein coagulation）
蛋白质经强酸、强碱作用变性后，仍能溶解于强酸、强碱中，若将pH调节至等电点，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍能溶解于强酸、强碱中，这种现象称为~。

（四）蛋白质的紫外吸收
蛋白质：Tyr和Trp，280nm有最大吸收值，
故A280∝ protein浓度
（五）蛋白质的显色反应
1.茚三酮反应（ninhydrin reaction）
茚三酮 + 蛋白质 → 蓝紫色化合物（在570nm有最大吸收值）。
2.双缩脲反应（biuret reaction）
CuSO ₄ + protein or peptide → 紫色或红色

二、分离纯化蛋白质的意义

1.要研究某种蛋白质的结构与功能，生产高活性的蛋白质类激素、酶等，必须separation和purification。
2.在基因工程下游工作中，从“分泌型”的细胞质或从“包涵体”中获取具有生物活性的、纯度好的高蛋白质产品，需要separation和purification

三、蛋白质分离纯化的前处理
（一）生物样品的选择和处理
1.样品的选择：有效成分含量高、来源丰富、保持新鲜、实验条件恒定、取材工艺简单、有综合利用价值等。2.样品的处理
保存：-10℃冰箱临时保存，-20℃冰箱短期保存，-70℃冰箱长期保存。
预处理：包括去除脂肪、结缔组织等。
耐高温的成分：烘干长期保存。
有些样品可先冻干粉，再在冰箱中长期保存。