WESTERN BLOT检测蛋白

与DNA的Southern blot印迹相对应，蛋白质分析中应用的Western blot印迹技术也是通过对目标组分电泳分离，并转移至固相支持物（硝酸纤维膜），利用特异抗体作为探针，对靶物质进行检测。
蛋白质的Western blot结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫检测的特异敏感等多种优点，可检测到低至1-5ng中等大小的靶蛋白。

【试剂】
转移缓冲液: 25mM Tris-Cl, 192mM甘氨酸，20%甲醇(v/v), 0.01%SDS, pH8.3
漂洗液: PBS-Tween 20
150mM NaCl, 10mM Tris-Cl(pH7.4), 0.05% Teeen-20(v/v)
封闭液: 5%脱脂奶粉或3％BSA溶于10mM PBS-Tween 20
一抗: 特异的单克隆或多克隆抗体
酶标二抗
底物液：5mg DAB/ml 溶于0.05M柠檬酸－磷酸盐缓冲液(pH5.0)

【操作方法】
1．剪6张与电泳凝胶大小一致的Watman 3MM滤纸和1张硝酸纤维膜(NC)，带手套操作。
2．将上述滤纸及NC膜，浸入双蒸水中，再浸泡转移液中。
3．凝胶用双蒸水漂洗2次，再用转移液漂洗10分钟，2次。
4．按图示装好凝胶与NC膜，注意NC膜的药膜面朝向凝胶，膜与凝胶之间无气泡。
5．将装好的胶板插入转移槽中，注意NC膜位于阳极侧。
6．槽中加转移液，使之漫过铂金丝，接好冷却水系统。
7．电泳：6-10v/cm (电极距离)，1-16小时(依据转移效果)。
8．电泳完毕后，取出NC膜，用铅笔做好标记，漂洗液洗3次，每次5分钟。
9．封闭： 将NC浸入封闭液中1小时或4℃过夜。用漂洗液洗3次，每次5分钟。
10．将NC膜切成小条，放入反应槽中，加入稀释好的一抗，同时做阴阳对照。室温反应2小时，或4℃过夜。振荡漂洗3次，每次10分钟。
11. 加酶标二抗，室温反应1-2小时，振荡漂洗3次，每次10分钟。
12. 显色：加入底物液，至蛋白带清晰为止。
13. 终止反应： 水漂洗。

【转移事项】
1． 电泳毕可用含0.2%丽春红S的3％冰醋酸水溶液染NC膜，来观察转移结果和标准蛋白位置。 或用考马斯亮蓝染凝胶来观察转移效果。
2． 酶标二抗可以是IgG, IgM, IgA. 也可用酶标的SPA蛋白。
3．转移好的NC膜，如不接着做酶标反应，可在封闭后，漂洗，晾干，封于塑料袋中，4℃保存备用。

生物秀Western Blotting专题：
http://ask.bbioo.com/special/experiment/WesternBlotting.htm