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        质粒DNA的提取

        互联网

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        [实验原理]
        碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内,线状的DNA双螺旋结构解开变性,在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂,但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性,而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,不能迅速而准确地复性,它们缠绕形成网状结构。通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来,而质粒DNA却留在上清液中。

        [仪器、材料与试剂]
        (一)仪器
        1.恒温培养箱
        2.恒温摇床
        3.小型高速离心机
        4.高压灭菌锅
        (二)材料
        1.带有pQE-31质粒和pUC18-CAT质粒的两株大肠杆菌
        2.1.5mL 离心管
        3.枪头、枪
        (三)试剂
        质粒小量制备试剂盒(3S Spin plasmid MIniprep Kit V3.1,申能博彩公司)

        试剂盒的参考配方:
        Solution I
        50mmo1/L 葡萄糖
        5mmo1/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris・HCl(pH8.0)
        1.0 mmo1/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
        Solution II
        0.4mo1/L NaOH,2%SDS(十二烷基硫酸钠),用前等体积混合
        Solution III
        5mo1/L 醋酸钾 60 mL
        冰乙酸 11.5mL
        水 28.5mL
        TE缓冲液
        10mmo1/L Tris・HCl
        1mmo1/L EDTA(pH8.0)
        胰RNA酶(RNA酶A)
        将RNA酶溶于10mmo1/L Tris・HCl(pH7.5)、15mmo1/L NaCl中,配成10 mg/mL的浓度,于100℃加热15min,缓慢冷却至室温,保存于-20℃。

        [实验步骤]
        (一)提取质粒
        将3mL含Apm的LB液体培养基加入到两支试管中,分别接入含pQE-31质粒和pUC18-CAT的大肠杆菌,37℃振荡培养过夜。
        以下的操作按试剂盒的说明书进行。(附试剂盒说明书)
        (二)质粒的琼脂糖凝胶电泳
        将5mL洗脱液与3mL的DNA样品缓冲液混合,加于1.2% Agarose 做凝胶电泳分析。

        附:试剂盒说明书

        3S Spin Plasmid Miniprep Kit V 3.1

        试剂盒组成:
        组成 K1910(50次) K1920(100次) K1930(250次)
        Solution I(a) 5m 1 10m 1 25m 1
        Solution II(b) 10m 1 20m 1 50ml
        Solution lll 20m 1 50m 1 2x50m 1
        Wash Solution (c) 22m 1 2x22m 1 5x22m 1
        TE(d) 5m 1 10m 1 40m 1
        3S Column 50支 100支 250支
        Co11ection tube 50支 100支 250根
        说明书 1份 1份 l份

        注:
        a)Solution I内含RNaseA,每次实验结束后,4℃保存。
        b)温度低时,Soluion II有白色沉淀析出,37度以下保温溶解,摇匀后使用。
        c)首次使用前,必须在Wash Solution 瓶中加入50ml无水乙醇,充分混勾后使用。每次使用后将瓶盖旋紧,以保持Wash Solution中的乙醇含量。
        d)TE pH8.0或者水均可以用十洗脱,但是用水洗脱DNA,效率通常要低―些。抽提测序用质粒需要用水洗脱。
        主要特点:
        ● 采用改良的碱裂解方法,质量稳定,重复性好。
        ● 经济快速,每个抽提可以在20分钟内完成。
        ● 无需酚抽提,无需乙醇沉淀,无需CsCl离心。
        ● 质粒纯度高,洗脱体积小,适合于DNA全白动荧光测序。

        实验操作步骤(从细菌中抽提质粒)

        1.将过夜培养的2m1细菌,测序用质粒抽提请用5m1细胞,高速离心1分钟,彻底去除上清。
        2.加入100ml solution I,用枪头或振荡器充分悬浮细菌。
        注意:对于低拷贝数的质粒,请用5m1细胞;
        质粒如果用于全自动荧光测序分析,请用5ml细胞,无需提高SolutionI,II和III的用量。
        3.加入200ml Solution II,立即上下颠倒或用手指弹管底,使细菌裂解,室温放置(2分钟左右)至溶液变成澄清。
        4.加入400ml Solution III,立即上卜颠倒5―10次,使之充分中和,室温放置2分钟。
        注意:步骤2和3在冰上操作效果更佳。
        5.高速离心,15,000转/分钟,10分钟。无需低温离心。
        注意:提高离心速度,使沉淀更加紧密,步骤6操作取上清更为方便。
        6.取出2m1样品收集管和3S柱,在管壁标上样品号,将步骤5中的上清全部转移到(吸或倒入)3S柱里。盖上离心管盖子(盖子也可以不盖,但是如果您同时有很多样品,担心混淆或弄翻溶液,建议您盖上盖子),室温放置2分钟 (室温放置时间不重要,可长可短);用台式离心机室温高速(12,000转/分钟)离心1分钟。
        注意:转移上清时不要吸取沉淀,否则会出现Genomic DNA和蛋白质污染。
        离心管盖子盖上时,柱子内压的增加,可能会使部分溶液从柱子底部流出,为正常现象。
        7.取下3S柱,弃去掉收集管中的废液,将3S柱放入同一支收集管中,吸取700ml Wash Solution到3S柱,离心1分钟。
        8.重复步骤7一次。
        9.取下3S柱,弃去掉收集管中的废液,将3S柱放入同―支收集管中,高速离心2分钟。
        10.将3S柱放入干净的1.5m1的离心管中,在3S柱子膜中央加 50ml TE或水,不要盖上离心管盖, 室温下放置2分钟;盖上离心管盖,室温高速离心1分钟。
        注意:将TE或水预热到50℃左右可以提高洗脱效率。测序用质粒用30ml预热的水洗脱,浓度一般满足测序要求。
        11.洗脱的质粒可以立即用于各种分子生物学操作或-20℃保存备用。lml过夜培养细胞,质粒如果用50ml水洗脱,通常情况下可以取10ml洗脱液做Agarose电泳或酶切分析。

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