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        鼠卵细胞DNA的提取

        互联网

        3241
         

        一、试剂:
        TNE :
        10mmol/L Tris cL (ph 8.0)
        100 mmol/L NaCl
        1 mmol/L EDTA
        10%的SDS
        酚、氯仿、乙醇
        二、操作步骤:
        (1)收集鼠卵细胞,PBS 漂洗3次;
        (2)将细胞悬浮于500 ul的TNE缓冲液中;
        (3)加入6 ul20mg/ml蛋白酶K和50ul10%SDS,轻缓摇动;
        (4)37℃保存1-4小时;
        (5)加入等体积250ul饱和酚和氯仿,轻摇15-20分钟,1200rpm离心5分钟,用大口径吸管转移上清;
        (6)用2倍体积的乙醇(室温),轻摇至DNA出现;
        (7)12000rpm离心10 min,20ul TE溶解。

        个人心得:
        1. 卵细胞与一般的培养细胞系明显不同,收集卵细胞后一般都是在显微镜下计数细胞的个数,常常只有几十个或上百个细胞,所以裂解前要尽量少带其它液体。
        2. 卵细胞表面的颗粒细胞等要去除干净。消化时用的胰酶或透明酯酸酶要尽量去除。

        一、小鼠卵细胞的收集(适用于 昆明小鼠,BALB/c)
        1、第一天PM5:30 7.5IU PMSG注射,第三天PM5:30 即48小时后,7.5IUHCG注射,第四天8:30即15小时后,杀鼠取卵子;用0.1%胰酶去处透明带;

        二、卵细胞培养有关的培养基:
        1、M2和TYH
             M2       TYH  
        NaCl     553.4      697.6  
        KCl    35.6      35.6  
        CaCl2 H2O    25.1      25.1  
        KH2PO4    16.2      16.2  
        MgSO4 7H2O    29.3      29.3  
        NaHCO3    33.6      210.6  
        HEPES    500.5        
        Lactic acid(Sodium salt)    435.2(60%的溶液0.39ml)        
        Pyruvic acid(Sodium salt)    3.6      11  
        Glucose    100.2      100.2  
        BSA    400      400  
        庆大霉素    20000IU(500ul)      20000IU(500ul)  
        用去离子水做溶剂,配完要过滤,整个过程要无菌操作。M2和TYH用之前要预温,培养卵时TYH应做成液滴预温2小时

        2 、CZB 单位(mg/100ml)
        NaCl 447.0
        KCl 36.0
        CaCl22H2 O 25.0
        KH2PO4 16.1
        MgSO4 7 H2 O 29.1
        NaHCO3 211.1
        60%乳酸钠 0.58ml
        丙酮酸钠 3.0
        BSA 500
        青霉素 6.0
        链霉素 5.0
        1%酚红 100ul4.1
        EDTA Na2 4.1

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