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        火箭免疫电泳法测定补体C4、B因子

        互联网

        1958

        1、主要试剂

        (1)羊抗人C4抗血清 按说明书所示单扩效价扩大2-4倍稀释,或分别用含不同浓度抗体的琼脂糖凝胶浇板,选择峰高、清晰度适当的抗体浓度为最适工作浓度;

        (2)羊抗人B因子抗血清 按说明书所示单扩效价扩大3-5倍稀释,也可按选择C4抗血清稀释浓度的方法确定最适工作浓度;

        (3)电泳缓冲液 称取10.30g巴比妥钠,1.83g巴比妥,溶于1000mL蒸馏水中。此液为pH8.6,离子强度0.05的巴比妥缓冲液;

        (4)凝胶缓冲液 以定量测定时用1:4稀释的电泳缓冲液,B因子定量时1:5稀释;

        (5)染色液 0.25%考马斯亮蓝,称取0.25g考马斯亮蓝R-250,溶于100mL脱色液中;

        (6)脱色液 甲醇900mL、冰醋酸200mL、蒸馏水900mL。

        2、操作步骤

        (1)1%琼脂糖凝胶板的制备:称取0.50g琼脂糖和1z聚乙二醇(PEG 6000)置100ml三角烧瓶中,加入50ml凝胶缓冲液,隔水煮沸至琼脂糖完全溶解,55℃保温;加入适量的抗C4血清或抗B因子血清(预先实验选定)混匀,浇板,凝胶厚度lmm。沿阴极端约2cm处打孔,孔间距6-8mm,孔径3-3.5mm;

        (2)待测样本用凝胶缓冲液1:10稀释,参考血清对倍稀释(一般作5个稀释度),每孔加5-I0ul;

        (3)将样本孔端接负极,电压12.5V/cra电泳5h;

        (4)取出凝胶板,用生理盐水漂洗2次,去离子水漂洗1次;

        (5)将干净滤纸铺在凝胶板上,干燥、常规染色、脱色;

        (6)结果计算:量取各火箭峰的高度,根据峰高—浓度标准曲线计算待测样本中C4或Bf含量。

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