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        固相团集素结合测定法

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        1084

        实验原理

         

        团集素是牛血清中的一种蛋白质,它与结合在细胞表面和循环中的免疫复合物上的补体C3碎片有强烈的结合性。当把团集素包被在固相载体后,被检血清中结合有补体的免疫复合物就可与其结合,用同位素或酶标记的抗体即可检出。团集素无种属特异性,耐热,能长期保存,因此,用团集素检测循环免疫复合物更为方便。

        实验试剂

         

        1. VBS(含Ca2 、Mg2 )

        2. pH值7.2、0.15mol/L PBS(含0.02mol/L EDTA)

        3. pH值5.4、0.01mol/L PBS

        4. 牛血清

        实验设备

         

        1. Sepharose 4B
        2. DEAE纤维素柱用pH值8.0、0.01mol/L EDTA、0.03mol/L PBS(含0.03mol/L NaCl)平衡

        实验步骤

         

        1. 提取方法

           1) 取牛血清1600ml,56℃灭活30min。

           2) 加等量VBS(含Ca2 、Mg2 ),混合后,再加一个压积容积的Sepharose 4B。

           3) 将其混合后,放室温2h,其间不时搅拌,让牛团集素结合到Sepharose 4B上。

           4) 用10容积VBS冲洗Sepharose 4B,可用布氏漏斗、玻璃滤器等。

           5) 用800~1000ml pH值7.2 PBS(含0.02mol/L EDTA)解脱牛团集素(可在容器内混合作用1h)。

           6) 用pH值5.4、0.01mol/L PBS透析洗脱液。

           7) 透析过后,牛团集素即沉淀下来,然后用pH值7.2 PBS(含0.02mol/L EDTA)将其溶解。

           8) 过DEAE层析柱用梯度洗脱,氯化钠溶液梯度从0.03→0.4mol/L,团集素最后即被洗脱下来。1600ml牛血清,大约可提取团集素7mg。

        2. 团集素活性滴定法

           1) EAC43d制备取已洗好的10%绵羊红细胞1容积加1容积稀溶血素混合,于37℃作用1h,用VBS洗2次,配成1%EAVBS混悬液。取8~10mg酵母多糖加1ml新鲜血清混合后,置37℃ 45min,离心,上清液已不含C5~C9。取10ml 1%EA,37℃预温后,加1ml去C5~C9的血清,37℃搅拌10min,用冷CFD洗2次,配成1% EAC43d VBS悬液备用。

           2) 凝集滴定法取团集素用含0.1%明胶的VBS对倍稀释(可用微量血凝板),最终每孔含不同稀释度的团集素50μl,每孔加50μl 1% EAC43d,振摇混匀后,4℃过夜。发生凝集的最高终点稀释度即为团集素单位数。

        3. 测定方法(放射免疫法)

           1) 取纯化的团集素用pH值9.5 VBS(含0.02%NaN3 )稀释到5μg/ml。取聚苯乙烯塑料管,每管加该团集素0.25ml,置37℃ 3h,使团集素包被在塑料管壁上(包被后,可用1个月以上)。

           2) 实际测定前,用含0.05%Tween20的VBS冲洗3次,每次静置3min,吸干后,加入各试液,室温作用1h,用VBSTween20冲洗3次,每次静置3min,吸干后,各管加125I标记的抗IgG 0.2ml(加入标记抗体含量应预先调试恰当),置室温4h,用VBSTween20洗3次后,用γ计数器测定cpm。

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