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        免疫复合物的纯化

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        1239

        实验试剂

         

        裂解缓冲液

        抗体

        蛋白A或蛋白G微球(用含0.02％叠氮钠裂解缓冲液配成10％(V／V)的混悬液，4℃保存)

        不含DTT的Laemmli样品缓冲液(2％SDS、10％甘油、60mmol／LTris，pH6.8和0.02％溴酚蓝)

        1mol／LDTT(保存于-20℃)

        实验设备

         

        摇床、抽吸装置(大多是通过导管与负压瓶一室内真空器连接)

        实验步骤

         

        1．准备工作

        蛋白A或蛋白G微珠混悬液可在用前准备，4℃保存于含叠氮钠的溶液中。

        2．操作步骤

           1) 将小量裂解物样本分别置于适当数量的1.5mlEP管中，加入裂解缓冲液，至终体积接近0.5 mol。加入抗血清(1ul)、杂交瘤细胞培养上清液(50ul)或小鼠腹水(0.5ul)作为抗体的起始用量。滴定时抗血清用0.5-5ul，杂交瘤细胞培养上清液用10～100ul，腹水用0.1～1.0ul。

           2) 冰上孵育1h。高亲和力的结合反应在1h内完成。因而，1h的孵育时间可使大部分的抗体完成反应。

           3) 在抗体-抗原反应液中加入100ul蛋白A或蛋白G微球(用裂解缓冲液配制成10％混悬液)，4℃摇动孵育1h。

        尽管有些操作手册建议反应过夜，但实际上并无好处，还会增加背景，因此不主张反应过夜，除某些特殊情况外。

        在每一步操作的最后，尽可能完全去除洗涤缓冲液，有利于降低背景。建议在真空泵吸气管末端使用23号针，或用微量加样枪头以减慢流速，控制微球，如果枪头很小可直接插入微球中去除洗涤缓冲液。若微球黏附针孔，在管壁上轻弹即可去除。


        4) 以10000g，4℃离心15s，收集微球。用裂解缓冲液清洗免疫复合物3次。裂解产物和洗涤缓冲液很容易通过抽吸法除去。

        5) 尽可能完全吸去最后一次的洗涤液，将免疫复合物用于相应的实验。

        用于SDS-PAGE时，加入50ul Laemmli样品缓冲液(2％SDS、10％甘油、100mmol／LDTT、60mmol／LTris，pH6.8和0.01％溴酚蓝)，加热10min，离心，吸取上清液，将其作为样品加入凝胶内进行电泳。若暂不进行凝胶电泳，可将样本置于-20℃保存。

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