• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        免疫复合物的纯化

        互联网

        1234

        实验试剂

         

        裂解缓冲液

        抗体

        蛋白A或蛋白G微球(用含0.02%叠氮钠裂解缓冲液配成10%(V/V)的混悬液,4℃保存)

        不含DTT的Laemmli样品缓冲液(2%SDS、10%甘油、60mmol/LTris,pH6.8和0.02%溴酚蓝)

        1mol/LDTT(保存于-20℃)

        实验设备

         

        摇床、抽吸装置(大多是通过导管与负压瓶一室内真空器连接)

        实验步骤

         

        1.准备工作

        蛋白A或蛋白G微珠混悬液可在用前准备,4℃保存于含叠氮钠的溶液中。

        2.操作步骤

           1) 将小量裂解物样本分别置于适当数量的1.5mlEP管中,加入裂解缓冲液,至终体积接近0.5 mol。加入抗血清(1ul)、杂交瘤细胞培养上清液(50ul)或小鼠腹水(0.5ul)作为抗体的起始用量。滴定时抗血清用0.5-5ul,杂交瘤细胞培养上清液用10~100ul,腹水用0.1~1.0ul。

           2) 冰上孵育1h。高亲和力的结合反应在1h内完成。因而,1h的孵育时间可使大部分的抗体完成反应。

           3) 在抗体-抗原反应液中加入100ul蛋白A或蛋白G微球(用裂解缓冲液配制成10%混悬液),4℃摇动孵育1h。

        尽管有些操作手册建议反应过夜,但实际上并无好处,还会增加背景,因此不主张反应过夜,除某些特殊情况外。

        在每一步操作的最后,尽可能完全去除洗涤缓冲液,有利于降低背景。建议在真空泵吸气管末端使用23号针,或用微量加样枪头以减慢流速,控制微球,如果枪头很小可直接插入微球中去除洗涤缓冲液。若微球黏附针孔,在管壁上轻弹即可去除。


        4) 以10000g,4℃离心15s,收集微球。用裂解缓冲液清洗免疫复合物3次。裂解产物和洗涤缓冲液很容易通过抽吸法除去。

        5) 尽可能完全吸去最后一次的洗涤液,将免疫复合物用于相应的实验。

        用于SDS-PAGE时,加入50ul Laemmli样品缓冲液(2%SDS、10%甘油、100mmol/LDTT、60mmol/LTris,pH6.8和0.01%溴酚蓝),加热10min,离心,吸取上清液,将其作为样品加入凝胶内进行电泳。若暂不进行凝胶电泳,可将样本置于-20℃保存。

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序