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        yeast transformation

        互联网

        1067

        实验步骤

         

        小剂量:

        1.  制作感受态。

        a. 在500ml锥形瓶中摇100ml 酵母菌种直到OD值达到0.4(30℃),然后分装为两个50ml离心3000g五分钟。

        b. 弃上清,用20mlddH2O 冲悬,离心3000g五分钟。

        c. 弃上清,用10ml 1XTE/LiAc冲悬,离心3000g五分钟。

        d. 小心弃上清,用175μl1XTE/LiAc冲悬。

        2.  转化

        a. 每个转化需要50μl 细胞,5μl刚煮过的carrier DNA, 以及100ng质粒,混匀后加300μl PEG/LiAc。

        b. 水浴30℃30分钟。

        c. 水浴热激42℃15分钟。

        d. 室温高速离心弃上清,然后用500μl ddH2O冲悬图板。

        大剂量(library)

        1.  制备特定感受态

        a. 用小剂量的方法先将感兴趣的蛋白转到感受态中,然后再用该菌株制备感受态。

        b. 先在3ml单缺的培养基里培养细胞8-12h,然后从中转移20μl到50ml选择培养基中培养16-20小时,待OD达到0.15-0.3。

        c. 700g5min集菌,弃上清,再用100mlYPAD冲悬起来,继续在30℃中培养3-5hrs到OD 0.4。

        d. 700g五分钟集菌(50ml的管子中分为两管),弃上清,用60ml(30each)ddH2O冲悬。然后再集菌弃上清,用3ml 1.1X TE/LiAc冲悬.

        e. 室温高速离心,弃上清,用600μl1.1XTE/LiAc冲悬。

        f. 在预冷的15ml的管子里加入1-10μg文库DNA,20μl carrier DNA, 600μl感受态细胞混匀,再加2.5mlPEG/LiAc,混匀。30度45分钟水浴,每15 分钟混匀一次。

        g. 加160μlDMSO混匀水浴42度20 分钟。每十分钟混匀一次。

        h. 700g离心去上清,3mlYPAD冲悬在30度摇90分钟。离心集菌,去上清,最后用15ml0.9%NaCl冲悬,涂板。

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