(交流）原位杂交操作技术步骤

原位杂交操作技术

一、准备实验所需的实验器材和试剂：
器材：染色缸（立式或卧式） 一个 量筒（配SSC和PBS用） 两只
处理好的盖玻片 小镊子 一个
（置瓷盘内150℃烤3小时备用）
另准备五个500ml试剂瓶（用来装DEPC水，1×PBS，2×SSC，含0.1%SDS的2×SSC,含0.1%SDS的0.1×SSC）
试剂：二甲苯 无水乙醇 90%乙醇
（0.1%DEPC处理的）双蒸水（灭菌1小时备用）
蛋白酶K（1mg/ml in PH8.0 TE）------ 分装后置-20℃保存
20×SSC 10×PBS
（DEPC处理的）含50%甲酰胺的杂交液（HS）--- 1ml分装后置-20℃保存
10×阻断液（10×BS）
Buffer I Buffer II Buffer III
探针（P） 抗Dig-Ap NBT/BCIP

二、操作流程:
1）  脱蜡至水：
二甲苯5min×2 → 90%乙醇5min → DEPC水洗涤5min×2
2）  杂交前处理：
1×PBS洗涤5min → 蛋白酶K（终浓度20ug/ml in PBS）37℃ 30min → 1×PBS洗涤5min×2 → 2×SSC洗涤5min
3）  预杂交：
滴加HS于室温预杂交30min
4）  杂交：（探针于HS中保存，可反复使用，每次杂交前变性）
探针（终浓度1ug/ml in HS）煮沸变性10min后冰浴 → 吸去HS后，每片滴加变性探针20ul左右 → 150℃烤过的盖玻片封片（注意不能产生气泡） → 置湿盒中80℃ 15min后转入42℃过夜
5）  杂交后洗涤：
2×SSC（含0.1%SDS）洗涤三次共30min → 0.1×SSC（含0.1%SDS）洗涤三次共30min
6）  加酶标抗体：
Buffer I 平衡5min → 加1×BS（in Buffer I） 室温 30min → 加抗Dig-Ap（1：500/1000 in Buffer II）室温3小时
7）  显色：
Buffer I（含0.3%Tween-20）洗5min×3 → 加Buffer III平衡4min → 吸去Buffer III后加NBT/BCIP（1：50 in Buffer III）置湿盒内避光室温过夜
8）  复染封片：
水洗终止显色 → 核固红复染2min → 常规脱水透明中性树胶封片（与免疫组化相同）

三、注意事项
1）  RNA杂交时，杂交前所用试剂均需用DEPC处理，所用器皿需150℃烤以去除RNA酶。
2）  DEPC处理双蒸水或其他试剂：蒸馏水或配好的试剂中加入0.1%DEPC → 充分振摇使油性的DEPC溶解 → 高压灭菌30min×2次 → 4℃保存
3）  所需试剂储备：
1M 马来酸（Maleic acid） PH7.5
0.5M Tris-Cl PH9.5
5M NaCl 1M MgCl 10% SDS
4）  试剂配制：
20×SSC : Nacl 175.3g（3M） 加水至1L，1N HCl调PH至7.0，
柠檬酸钠 88.2g（0.3M） （0.2%DEPC）高压灭菌，4℃保存。
10×PBS： NaH2PO4 4.2g 加蒸馏水至1L，调PH至7.0。
Na2HPO4 4.2g 高压灭菌，4℃保存
NaCl 87.5g
Buffer I: 1M 马来酸 PH7.5(0.1M） 100ml 加水至1L（高压灭菌）
5M NaCl（0.15M） 30ml
Buffer II: 0.1×BS in Buffer I
Buffer III: 0.5M Tris-Cl PH9.5（0.1M） 200ml 加水至1000ml
5M NaCl（0.1M） 20ml （高压灭菌）
1M MgCl2（50mM） 50ml