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        我的总RNA提取到底出了什么问题?

        丁香园论坛

        1686
        玻璃器具、研钵处理方法:
        洗洁精洗后自来水冲7遍,双蒸水冲3次,60℃烤干,泡酸过夜后自来水冲7遍,双蒸水冲3次。烤干,150℃烤4小时。
        枪头、EP管等处理方法:
        0.1%DEPC溶液浸泡过夜,取出高压灭活DEPC 15分钟。
        实验用水:
        均用0.02%DEPC处理水配制。0.02%DEPC处理水配制方法:配0.02%DEPC水溶液,15Psi高压15分钟。
        组织处理:迅速取出称取100mg,放入1.5 ml EP管中(未处理),置-70℃保存。
        提取方法:
        1.  将组织取出,在-20℃预冷的研钵中冰浴研碎,1mlTRIZOL将组织冲洗入DEPC处理1.5mlEP管中,室温5分钟。或直接将1mlTRIZOL加入预冷玻璃匀浆器中,冰浴中匀浆后将匀浆液转到EP管。
        2.  加0.2ml 氯仿,用力摇15秒后,室温3分钟。
        3.  12000g 室温离心10分钟。
        4.  将水样层转移到另一干净EP管中。
        5.  加0.5ml 异丙醇,室温10分钟。
        6.  12000g 室温离心10分钟,倾去上清,加1ml 75% 乙醇。
        7.  7500 g离心5分钟,吸去上清,自然干燥10分钟。
        8.  加40微升DEPC处理水溶解。
        9.  58℃温育10分钟促其溶解。
        10.  取10微升,溶于2ml TE 缓冲液中,以TE为空白对照,测A260/A280。通常测出A260/A280为1,有时更小。
        11.  取8微升,加2微升上样缓冲液,于1.5% 琼脂糖凝胶中 150V 电泳10分钟至半小时(undefinedTBE电泳缓冲液)。结果只可见5S带。

        因为不成功,所以我重新处理了实验用器具并重新配制了所有试剂,(氯仿和异丙醇没有重新处理).但情况还是一样.
        因为取出组织我没有经过液氮速冻,而是直接放在-70度冰箱中,我想是不是样品保存条件不好,所以我又将新鲜组织取出后立即置于TRIZOL中匀浆,结果和以前一样.
        于是我怀疑是不是TRIZOL有问题,在医院检验科要了一个小包装的丙肝RT-PCR试剂盒的单相裂解液重复了一次,还是不成功.仍是只见5S带.
        现在我真的是想不出来还有什么问题了.xx(:?):?)
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