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丁香园论坛
1421
MDR1基因C3435T多态性对重症肌无力患者环孢素血药浓度的影响
Effect of MDR1 gene C3435T polymorphism on pharmacokinetics of cyclosporine A in
摘要：目的 研究MDR1基因C3435T多态性与重症肌无力患者环孢素药物动力学的关系。方法 采用荧光PCR的方法对96名重症肌无力(MG)患者检测MDR1 C3435T基因型，对其中73名临床资料较全者的环孢素用药及血药检测结果与基因型结果进行分析。结果 重症肌无力患者MDR1 C3435T的分布频率接近1：1；野生型3435CC患者的环孢素全血谷浓度高于杂合型和突变型（p<0.05），杂合型与突变型之间无显著性差异（p>0.05）。结论 药物遗传学研究对环孢素治疗重症肌无力患者的临床合理用药有指导意义。
关键词： MDR1； 重症肌无力； 环孢素； 荧光PCR ；药物遗传学
Abstract: objective To determine whether MDR1 C3435T effect the pharmacokinetics of cyclosporine A in myasthenia gravispatients. Methods 96 myasthenia gravis patients were genotyped on MDR1 C3435T using real-time PCR method and 73 patients of them were studied further to determine the relationship of MDR1 C3435T polymorphism and trough blood concentrations of cyclosporine A .Results There are no difference between normal people and myasthenia gravis patients in MDR1 C3435T distribution; the average concentrations in patients of MDR1 3435CC was higher than ones in patients of MDR1 3435CT and 3435TT. Conclusion There are some meaningfulness to rationalize the medication of cyclosporine A through the investigations of pharmacogenomics.
Key words: MDR1; myasthenia gravis; cyclosporine A; real-time PCR; pharmacogenomics.
MDR1基因(多药耐药基因1)产物P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gP)是人体药物处置中最重要的ABC(ATP biding cassette)转运体，它在抗肿瘤药物多药耐药研究中首先被发现。MDRl基因定位在人体7号染色体长臂2区1带(7q21)，由28个外显子组成，编码1280个氨基酸，分子质量约为170kb。现在认为P-gP类似于一种泵将其底物从细胞内转运至细胞外[ ]。P-gP能够转运许多化学结构不同的化合物，如抗癌药物、心血管类药物(如地高辛、奎尼丁、β－肾上腺素受体拮抗剂)，HIV蛋白酶抑制剂（茚地那韦）、免疫抑制剂(环孢素)等。
迄今为止，在MDR1中已经发现了28个SNP（single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性），其中影响最大、研究最多的是MDR1 C3435T。虽然MDR1 C3435T属沉默突变，并没有影响P-糖蛋白的氨基酸结构，但是C3435T与MDR1很多表型相关，包括MDR1基因的表达、表达产物P-糖蛋白的功能以及P-糖蛋白对底物的转运。多项临床实验已经证实非索非那定、依法维伦、那非那韦、他克莫司、地高辛的吸收代谢与MDR1 C3435T相关[ ]。
免疫抑制剂环孢素 (cyclosporineＡ，CsA)，P-糖蛋白底物之一，常用于防治肾、肝、胰、心、肺等器官的移植后排异反应，同时它也应用于各种难治性自身免疫性疾病。但是环孢素生物利用度和药代动力学存在较大的个体间差异，并且治疗窗狭窄，因此临床上通过监测环孢素的全血谷浓度来指导用药，达到保证疗效避免不良反应的目的。
本研究用实时荧光PCR的方法检测了96名服用环孢素并监测其血药浓度的重症肌无力患者基因型，旨在探索MDR1 C3435T多态性对环孢素药代动力学的影响
1 材料和方法
1.1 实验对象 ：共收录重症肌无力患者96名 (男性40 名女性 56名)。年龄13～81岁，平均年龄(46±19)岁，体重(67.4±10)kg，身高(166±6.5)cm。
1.2 血样采集：晨5点钟取空腹静脉血2～3mL，肝素抗凝。
1.3 环孢素全血浓度测定：用荧光偏振免疫分析法测定CsＡ血药浓度(CsＡ单克隆试剂盒、TDX全自动荧光偏振分析仪，美国ABBOTT公司产品)，所测浓度均为谷浓度。同时测定患者的血、尿常规及肝、肾功能。
1.4 全血DNA提取：人血基因组DNA的提取应用基因组DNA提取试剂盒（离心柱型，北京天为时代），按照试剂盒提供步骤提取。
1.5 荧光PCR法测定基因型：利用等位基因特异性PCR的原理（allele-specific PCR），以sybr greenⅠ荧光为基础，每个样本进行两个独立的实时PCR反应（反应Ⅰ和Ⅱ）。引物序列和PCR步骤见原文[ ]。
RFLP分析
1.6 RFLP分析验证：根据以上方法鉴定出结果的样本每种基因型各选一到两个进行传统RFLP（限制型酶切片断长度多态性）分析。根据已知的外显子26的序列 (Genbank: J05168 和 AC 005068)设计了以下两条引物MDR1F (5’－TGCTGGTCCTGAAGTTGATCTGTGAAC-3’) 和 MDR1R (5’-ACATTAGGCAGTGACTCGATGAAG GCA-3’)用于扩增外显子26。PCR反应体系如下：反应体积20ml包含100ng基因组DNA，每条引物浓度0.25mmol.l－1，10×PCR buffer（Tris-HCl 10mmol.l－1 ，KCl 50mmol.l－1）， MgCl2 1.5mmol.l－1，每种dNTP各200 mmol.l－1，Taq DNA polymerase 1U。PCR反应条件如下：94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次，最后72℃延伸5min。产物用限制型内切酶MboI 37℃消化2h。然后用2% agarose gel的分离并照相（图2）。
1.7 统计分析：作图用Graphpad prism® 4.0（Graphpad Software，Inc），统计用Spss 12.0 standard version（Spss Inc.），统计学方法用双侧t检验或X2检验。
2 结果
2.1 荧光PCR检测结果
基因型为杂合子（MDR1 3435 C T）的模板，在反应Ⅰ和Ⅱ中都可以产生可检测水平的特性产物（134bp，Tm＝84ºC），基因型为野生纯合子（MDR1 3435 CC）的模板，仅在反应Ⅰ中可以产生可检测水平的特性产物，基因型为突变纯合子（MDR1 3435 TT）的模板，仅在反应Ⅱ中可以产生可检测水平的特性产物(图1)
Figure 1 Melting curve of PCR product of typical genotypes for the MDR1 C3435T
A
B
C
After amplification, melt analysis was performed by heating the reaction mixture from 60ºC to 95ºC at the rate of 0.2ºC/s ,and the melt curves were converted to melt peaks by plotting the negative first derivative of the fluorescence versus temperature ([-dF/dt]). The melt temperature (Tm = 84°C) was identical for PCR products formed using either the wild-type or mutant-specific primers.
A heterotype(3435CT); B mutent homotype(3435 T T); C wild homotype(3435 C C)
2.2 RFLP 鉴定结果
对通过荧光PCR检测鉴定出结果的样本每种基因型各选一到两个进行RFLP分析，图示(图2)是一个野生纯合，突变纯合和两个杂合子酶切电泳图。带有3435C等位基因的PCR产物（248bp）酶切片断分别为172bp、60bp（电泳图未见）、16bp（电泳图未见），带有3435T等位基因的PCR产物（248bp）酶切片断为232bp、16bp（电泳图未见），带有3435CT等位基因的PCR产物（248bp）酶切片断为232bp、172bp、60 bp（电泳图未见）、16 bp（电泳图未见）。RFLP 鉴定结果和荧光PCR检测结果完全一致。
Figure 2 Digestion of exon 26 of MDR1 by MboI (RFLP)
M DNA Marker; 1,4 heterotype(3435CT); 2 mutant homotype(3435 T T); 3 wild homotype(3435 C C)
2.3 重症肌无力患者C3435T等位基因的分布
96名重症肌无力患者中，MDR1基因野生纯合(3435 CC)27名，突变纯合(3435 TT)26名，杂合(3435 CT)42名，等位基因3435C:3435T的比例为51:49，该群体符合Hardy–Weinberg平衡 (X2=1.27; P=0.26)。
2.4 MDR1基因C3435T对环孢素全血谷浓度的影响
96名重症肌无力患者中，选择临床资料较全者73名，共检测血药浓度240人次（1～10次/人）。三种基因型分组之间血清肌酐浓度没有显著差异。由于用药剂量（每日）是影响血药浓度的主要因素，所以血药浓度用药量校正（血药浓度/用药剂量）[ ]。虽然有些文献认为体重是影响环孢素血药浓度的重要因素，但是体重与药物浓度的关系及其具体影响程度并不清楚，药物浓度未用体重校正。
Figure 3 The comparison of trough blood concentrations of cyclosporine A among different genotypes (n=23undefined)
~undefinedeach point present one concentration， and n presents the whole times of blood concentration assayed of the 73 patients who are allowed into the comparison study.
~undefined_genotype_3435CC_compared_with_3435CT_or_3435TT_p~L0.003_or_0.0147，genotype 3435CT compared with 3435TT p=0.642
图3 不同基因型的患者血药谷浓度的比较
~undefined每个数据点代表一个检测浓度
~undefined野生型与杂合型和突变型之间药物浓度药量比值有明显差别（p<0.05），杂合型与突变型之间未发现统计学上的差别。对于中位数和平均数，突变型<杂合型<野生型
用剂量标准化血药浓度前三种基因型血液浓度结果分别是：（131±69）ug/ml、(115±56) ug/ml、(107±60) ug/ml，剂量校正后的血药浓度（血药浓度/用药剂量）结果分别是：(0.74±0.40)ug.(ml.kg)-1、(0.59±0.27) ug.(ml.kg)-1、(0.57±0.26) ug.(ml.kg)-1，野生型3435CC患者的环孢素全血谷浓度高于杂合型和突变型（p<0.05），杂合型与突变型之间无显著性差异（p>0.05）。
3讨论
3.1 中国人群的遗传复杂性
下表为目前对中国正常人群MDR1 C3435T分布频率的部分研究数据与本论文对重症肌无力患者的研究结果对照（表1）。
Table 1 The comparison of different studies on the frequency ofC3435T in Chinese
Genotype frequency Allele frequency HWundefined Pairwise differencundefined~Kbr_~H~M~2~1Number_of_samples Sample sources CC CT TT C T p-value Han，MG patients
240 Han，healthy[ ] 37.1％（89） 44.2％（106） 18.7％（45） 0.59 0.41 0.18 0.047
111 Han，healthy[ ] 45.0％（50） 40.5％（45） 14.4％（16） 0.65 0.35 0.27 0.003
132 Chinese，healthy（USA）[ ] 31.8％（42） 42.4％（56） 25.8％（34） 0.53 0.47 0.09 0.634
96 Chinese，healthy（Singapore）[ ] 25％（24） 43.8％（42） 31.2％（30） 0.47 0.53 0.54 0.721
96 Han，MG patients 28.1％（27） 43.8％（42） 27.1％（26） 0.51 0.49 0.26 1
Data from this study are shown in bold
~undefinedHardy-Weinberg Equilibrium
~undefinedFisher’s exact P-value ， compared with the data from this study
表中所有人群均符合Hardy-Weinberg平衡（p≥0.05）。国外对于中国人群(Chinese)的研究往往选择在当地居住的华裔作为研究对象，由此推断出中国人群的SNP分布。国内研究SNP的分布，对研究对象做了进一步限定，选择当地的汉族人群作为研究对象。美国华裔和新加坡华裔的3435C的分布频率分别是47％和53％，而国内两组报道汉族正常人群MDR1基因3435C的检测结果分别是59％和65％，国外华裔3435C的分布频率明显小于国内汉族正常人群的分布频率。本研究结果与国外两项结果接近，而与国内两项结果有显著性差异（P<0.05）。
国内外对MDR1 C3435T的分布研究结果有明显差异，同时，即使是国内同样对汉族人群研究， 研究结果也有很大差异（0.59/0.41；0.65/0.35），所以，从遗传学上来讲，中国人群以及汉族人群这两个概念太大，存在较强的遗传多样性。
C3435T的发生率在健康人群和重症肌无力患者之间没有明显的差异（与岑宇翔等的研究结果比较），由此可见MDR1基因C3435T频率与重症肌无力患者疾病因素的关系不大。
3.2 C3435T的基因型与血药浓度的关系
关于C3435T与药物代谢动力学的关系的研究，主要主要集中在地高辛、非索非那定、那非那韦、洛哌丁胺、他克莫司以及环孢素几种药上。结果与基因表达和C3435T关系研究一样，有很多不一致的地方甚至是矛盾的地方。如KIM对60个健康个体口服非索非那定后血药浓度和基因型的关系研究发现：基因型3435TT的对象血药浓度低于基因型为3435CC和3435CT的人[ ]。Sakaeda等对日本人的MDR1基因型和地高辛血药浓度的研究得出了类似的结果[ ]。但是Becquemont 等的研究表明以基因型分组，3435TT组的地高辛平均血浆浓度高于CC3435组[ ]。
对于环孢素的几项研究结果如下：Von Ahsen等对124位肾移植患者维持环胞素治疗浓度而口服的环胞素剂量进行比较，未发现显著差异[7]。Min 和 Ellingrod 的研究显示单剂量口服给药后，C3435T 对环孢素的药代动力学同样没有改变[ ]。但是Balram等对10名口服环孢素的心脏移植的中国患者进行表现型基因型连锁分析，发现CC基因型患者的平均AUC（0.4h）比TT基因型的低11％[ ]。另外，Chowbay等对C1236T (exon 12)， G2677T (exon 21) and C3435T的三个位点的单体型研究结果表明带有TT1236、TT2677和TT3435单体型的个体的全血谷浓度比CC1236、GG2677 、CC3435的个体高[7]。
本研究结果与Balram等的结果相反，尽管杂合型与突变型之间无显著性差异（p>0.05），野生型3435CC患者的环孢素全血谷浓度高于杂合型和突变型（p<0.05）。导致不同研究结果不一致的原因可能有：
A. 本研究中，三组之间男女比例(三组分别为1.2，1，0.58)、体重（三组分别为70.5±10.6kg，66.8±13.80 kg，65.3±10.65）等指标并不完全相同，野生纯合型的男性比例较高，平均体重较高。
B. 小肠粘膜细胞中MDR1蛋白和CYP3A4基因的表达产物共同组成了环孢素的吸收屏障，但是血药浓度除了受吸收影响，还受分布，代谢，清除等环节的影响，另外，吸收过程中药物崩解，溶出，胃肠排空也是吸收的相关因素，因此用血药浓度是多个过程作用的共同结果，研究结果无法排除这些因素对血药浓度的影响。
C. SNP的连锁不平衡性。除了MDR1基因的一些位点，CYP3A家族基因的一些位点也与C3435T连锁，甚至CYP3A家族基因表达受到C3435T的影响。不同种族，不同人群的单体型不相同，导致单个SNP分析结果出现偏差
因此，同关于地高辛的研究相似，这些影响因素的作用可以掩盖甚至扭曲C3435T基因型与环孢素血药浓度的关系，因此有必要对环孢素药代动力学的遗传因素做进一步的研究。
Effect of MDR1 gene C3435T polymorphism on pharmacokinetics of cyclosporine A in
摘要：目的 研究MDR1基因C3435T多态性与重症肌无力患者环孢素药物动力学的关系。方法 采用荧光PCR的方法对96名重症肌无力(MG)患者检测MDR1 C3435T基因型，对其中73名临床资料较全者的环孢素用药及血药检测结果与基因型结果进行分析。结果 重症肌无力患者MDR1 C3435T的分布频率接近1：1；野生型3435CC患者的环孢素全血谷浓度高于杂合型和突变型（p<0.05），杂合型与突变型之间无显著性差异（p>0.05）。结论 药物遗传学研究对环孢素治疗重症肌无力患者的临床合理用药有指导意义。
关键词： MDR1； 重症肌无力； 环孢素； 荧光PCR ；药物遗传学
Abstract: objective To determine whether MDR1 C3435T effect the pharmacokinetics of cyclosporine A in myasthenia gravispatients. Methods 96 myasthenia gravis patients were genotyped on MDR1 C3435T using real-time PCR method and 73 patients of them were studied further to determine the relationship of MDR1 C3435T polymorphism and trough blood concentrations of cyclosporine A .Results There are no difference between normal people and myasthenia gravis patients in MDR1 C3435T distribution; the average concentrations in patients of MDR1 3435CC was higher than ones in patients of MDR1 3435CT and 3435TT. Conclusion There are some meaningfulness to rationalize the medication of cyclosporine A through the investigations of pharmacogenomics.
Key words: MDR1; myasthenia gravis; cyclosporine A; real-time PCR; pharmacogenomics.
MDR1基因(多药耐药基因1)产物P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gP)是人体药物处置中最重要的ABC(ATP biding cassette)转运体，它在抗肿瘤药物多药耐药研究中首先被发现。MDRl基因定位在人体7号染色体长臂2区1带(7q21)，由28个外显子组成，编码1280个氨基酸，分子质量约为170kb。现在认为P-gP类似于一种泵将其底物从细胞内转运至细胞外[ ]。P-gP能够转运许多化学结构不同的化合物，如抗癌药物、心血管类药物(如地高辛、奎尼丁、β－肾上腺素受体拮抗剂)，HIV蛋白酶抑制剂（茚地那韦）、免疫抑制剂(环孢素)等。
迄今为止，在MDR1中已经发现了28个SNP（single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性），其中影响最大、研究最多的是MDR1 C3435T。虽然MDR1 C3435T属沉默突变，并没有影响P-糖蛋白的氨基酸结构，但是C3435T与MDR1很多表型相关，包括MDR1基因的表达、表达产物P-糖蛋白的功能以及P-糖蛋白对底物的转运。多项临床实验已经证实非索非那定、依法维伦、那非那韦、他克莫司、地高辛的吸收代谢与MDR1 C3435T相关[ ]。
免疫抑制剂环孢素 (cyclosporineＡ，CsA)，P-糖蛋白底物之一，常用于防治肾、肝、胰、心、肺等器官的移植后排异反应，同时它也应用于各种难治性自身免疫性疾病。但是环孢素生物利用度和药代动力学存在较大的个体间差异，并且治疗窗狭窄，因此临床上通过监测环孢素的全血谷浓度来指导用药，达到保证疗效避免不良反应的目的。
本研究用实时荧光PCR的方法检测了96名服用环孢素并监测其血药浓度的重症肌无力患者基因型，旨在探索MDR1 C3435T多态性对环孢素药代动力学的影响
1 材料和方法
1.1 实验对象 ：共收录重症肌无力患者96名 (男性40 名女性 56名)。年龄13～81岁，平均年龄(46±19)岁，体重(67.4±10)kg，身高(166±6.5)cm。
1.2 血样采集：晨5点钟取空腹静脉血2～3mL，肝素抗凝。
1.3 环孢素全血浓度测定：用荧光偏振免疫分析法测定CsＡ血药浓度(CsＡ单克隆试剂盒、TDX全自动荧光偏振分析仪，美国ABBOTT公司产品)，所测浓度均为谷浓度。同时测定患者的血、尿常规及肝、肾功能。
1.4 全血DNA提取：人血基因组DNA的提取应用基因组DNA提取试剂盒（离心柱型，北京天为时代），按照试剂盒提供步骤提取。
1.5 荧光PCR法测定基因型：利用等位基因特异性PCR的原理（allele-specific PCR），以sybr greenⅠ荧光为基础，每个样本进行两个独立的实时PCR反应（反应Ⅰ和Ⅱ）。引物序列和PCR步骤见原文[ ]。
RFLP分析
1.6 RFLP分析验证：根据以上方法鉴定出结果的样本每种基因型各选一到两个进行传统RFLP（限制型酶切片断长度多态性）分析。根据已知的外显子26的序列 (Genbank: J05168 和 AC 005068)设计了以下两条引物MDR1F (5’－TGCTGGTCCTGAAGTTGATCTGTGAAC-3’) 和 MDR1R (5’-ACATTAGGCAGTGACTCGATGAAG GCA-3’)用于扩增外显子26。PCR反应体系如下：反应体积20ml包含100ng基因组DNA，每条引物浓度0.25mmol.l－1，10×PCR buffer（Tris-HCl 10mmol.l－1 ，KCl 50mmol.l－1）， MgCl2 1.5mmol.l－1，每种dNTP各200 mmol.l－1，Taq DNA polymerase 1U。PCR反应条件如下：94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次，最后72℃延伸5min。产物用限制型内切酶MboI 37℃消化2h。然后用2% agarose gel的分离并照相（图2）。
1.7 统计分析：作图用Graphpad prism® 4.0（Graphpad Software，Inc），统计用Spss 12.0 standard version（Spss Inc.），统计学方法用双侧t检验或X2检验。
2 结果
2.1 荧光PCR检测结果
基因型为杂合子（MDR1 3435 C T）的模板，在反应Ⅰ和Ⅱ中都可以产生可检测水平的特性产物（134bp，Tm＝84ºC），基因型为野生纯合子（MDR1 3435 CC）的模板，仅在反应Ⅰ中可以产生可检测水平的特性产物，基因型为突变纯合子（MDR1 3435 TT）的模板，仅在反应Ⅱ中可以产生可检测水平的特性产物(图1)
Figure 1 Melting curve of PCR product of typical genotypes for the MDR1 C3435T
A
B
C
After amplification, melt analysis was performed by heating the reaction mixture from 60ºC to 95ºC at the rate of 0.2ºC/s ,and the melt curves were converted to melt peaks by plotting the negative first derivative of the fluorescence versus temperature ([-dF/dt]). The melt temperature (Tm = 84°C) was identical for PCR products formed using either the wild-type or mutant-specific primers.
A heterotype(3435CT); B mutent homotype(3435 T T); C wild homotype(3435 C C)
2.2 RFLP 鉴定结果
对通过荧光PCR检测鉴定出结果的样本每种基因型各选一到两个进行RFLP分析，图示(图2)是一个野生纯合，突变纯合和两个杂合子酶切电泳图。带有3435C等位基因的PCR产物（248bp）酶切片断分别为172bp、60bp（电泳图未见）、16bp（电泳图未见），带有3435T等位基因的PCR产物（248bp）酶切片断为232bp、16bp（电泳图未见），带有3435CT等位基因的PCR产物（248bp）酶切片断为232bp、172bp、60 bp（电泳图未见）、16 bp（电泳图未见）。RFLP 鉴定结果和荧光PCR检测结果完全一致。
Figure 2 Digestion of exon 26 of MDR1 by MboI (RFLP)
M DNA Marker; 1,4 heterotype(3435CT); 2 mutant homotype(3435 T T); 3 wild homotype(3435 C C)
2.3 重症肌无力患者C3435T等位基因的分布
96名重症肌无力患者中，MDR1基因野生纯合(3435 CC)27名，突变纯合(3435 TT)26名，杂合(3435 CT)42名，等位基因3435C:3435T的比例为51:49，该群体符合Hardy–Weinberg平衡 (X2=1.27; P=0.26)。
2.4 MDR1基因C3435T对环孢素全血谷浓度的影响
96名重症肌无力患者中，选择临床资料较全者73名，共检测血药浓度240人次（1～10次/人）。三种基因型分组之间血清肌酐浓度没有显著差异。由于用药剂量（每日）是影响血药浓度的主要因素，所以血药浓度用药量校正（血药浓度/用药剂量）[ ]。虽然有些文献认为体重是影响环孢素血药浓度的重要因素，但是体重与药物浓度的关系及其具体影响程度并不清楚，药物浓度未用体重校正。
Figure 3 The comparison of trough blood concentrations of cyclosporine A among different genotypes (n=23undefined)
~undefinedeach point present one concentration， and n presents the whole times of blood concentration assayed of the 73 patients who are allowed into the comparison study.
~undefined_genotype_3435CC_compared_with_3435CT_or_3435TT_p~L0.003_or_0.0147，genotype 3435CT compared with 3435TT p=0.642
图3 不同基因型的患者血药谷浓度的比较
~undefined每个数据点代表一个检测浓度
~undefined野生型与杂合型和突变型之间药物浓度药量比值有明显差别（p<0.05），杂合型与突变型之间未发现统计学上的差别。对于中位数和平均数，突变型<杂合型<野生型
用剂量标准化血药浓度前三种基因型血液浓度结果分别是：（131±69）ug/ml、(115±56) ug/ml、(107±60) ug/ml，剂量校正后的血药浓度（血药浓度/用药剂量）结果分别是：(0.74±0.40)ug.(ml.kg)-1、(0.59±0.27) ug.(ml.kg)-1、(0.57±0.26) ug.(ml.kg)-1，野生型3435CC患者的环孢素全血谷浓度高于杂合型和突变型（p<0.05），杂合型与突变型之间无显著性差异（p>0.05）。
3讨论
3.1 中国人群的遗传复杂性
下表为目前对中国正常人群MDR1 C3435T分布频率的部分研究数据与本论文对重症肌无力患者的研究结果对照（表1）。
Table 1 The comparison of different studies on the frequency ofC3435T in Chinese
Genotype frequency Allele frequency HWundefined Pairwise differencundefined~Kbr_~H~M~2~1Number_of_samples Sample sources CC CT TT C T p-value Han，MG patients
240 Han，healthy[ ] 37.1％（89） 44.2％（106） 18.7％（45） 0.59 0.41 0.18 0.047
111 Han，healthy[ ] 45.0％（50） 40.5％（45） 14.4％（16） 0.65 0.35 0.27 0.003
132 Chinese，healthy（USA）[ ] 31.8％（42） 42.4％（56） 25.8％（34） 0.53 0.47 0.09 0.634
96 Chinese，healthy（Singapore）[ ] 25％（24） 43.8％（42） 31.2％（30） 0.47 0.53 0.54 0.721
96 Han，MG patients 28.1％（27） 43.8％（42） 27.1％（26） 0.51 0.49 0.26 1
Data from this study are shown in bold
~undefinedHardy-Weinberg Equilibrium
~undefinedFisher’s exact P-value ， compared with the data from this study
表中所有人群均符合Hardy-Weinberg平衡（p≥0.05）。国外对于中国人群(Chinese)的研究往往选择在当地居住的华裔作为研究对象，由此推断出中国人群的SNP分布。国内研究SNP的分布，对研究对象做了进一步限定，选择当地的汉族人群作为研究对象。美国华裔和新加坡华裔的3435C的分布频率分别是47％和53％，而国内两组报道汉族正常人群MDR1基因3435C的检测结果分别是59％和65％，国外华裔3435C的分布频率明显小于国内汉族正常人群的分布频率。本研究结果与国外两项结果接近，而与国内两项结果有显著性差异（P<0.05）。
国内外对MDR1 C3435T的分布研究结果有明显差异，同时，即使是国内同样对汉族人群研究， 研究结果也有很大差异（0.59/0.41；0.65/0.35），所以，从遗传学上来讲，中国人群以及汉族人群这两个概念太大，存在较强的遗传多样性。
C3435T的发生率在健康人群和重症肌无力患者之间没有明显的差异（与岑宇翔等的研究结果比较），由此可见MDR1基因C3435T频率与重症肌无力患者疾病因素的关系不大。
3.2 C3435T的基因型与血药浓度的关系
关于C3435T与药物代谢动力学的关系的研究，主要主要集中在地高辛、非索非那定、那非那韦、洛哌丁胺、他克莫司以及环孢素几种药上。结果与基因表达和C3435T关系研究一样，有很多不一致的地方甚至是矛盾的地方。如KIM对60个健康个体口服非索非那定后血药浓度和基因型的关系研究发现：基因型3435TT的对象血药浓度低于基因型为3435CC和3435CT的人[ ]。Sakaeda等对日本人的MDR1基因型和地高辛血药浓度的研究得出了类似的结果[ ]。但是Becquemont 等的研究表明以基因型分组，3435TT组的地高辛平均血浆浓度高于CC3435组[ ]。
对于环孢素的几项研究结果如下：Von Ahsen等对124位肾移植患者维持环胞素治疗浓度而口服的环胞素剂量进行比较，未发现显著差异[7]。Min 和 Ellingrod 的研究显示单剂量口服给药后，C3435T 对环孢素的药代动力学同样没有改变[ ]。但是Balram等对10名口服环孢素的心脏移植的中国患者进行表现型基因型连锁分析，发现CC基因型患者的平均AUC（0.4h）比TT基因型的低11％[ ]。另外，Chowbay等对C1236T (exon 12)， G2677T (exon 21) and C3435T的三个位点的单体型研究结果表明带有TT1236、TT2677和TT3435单体型的个体的全血谷浓度比CC1236、GG2677 、CC3435的个体高[7]。
本研究结果与Balram等的结果相反，尽管杂合型与突变型之间无显著性差异（p>0.05），野生型3435CC患者的环孢素全血谷浓度高于杂合型和突变型（p<0.05）。导致不同研究结果不一致的原因可能有：
A. 本研究中，三组之间男女比例(三组分别为1.2，1，0.58)、体重（三组分别为70.5±10.6kg，66.8±13.80 kg，65.3±10.65）等指标并不完全相同，野生纯合型的男性比例较高，平均体重较高。
B. 小肠粘膜细胞中MDR1蛋白和CYP3A4基因的表达产物共同组成了环孢素的吸收屏障，但是血药浓度除了受吸收影响，还受分布，代谢，清除等环节的影响，另外，吸收过程中药物崩解，溶出，胃肠排空也是吸收的相关因素，因此用血药浓度是多个过程作用的共同结果，研究结果无法排除这些因素对血药浓度的影响。
C. SNP的连锁不平衡性。除了MDR1基因的一些位点，CYP3A家族基因的一些位点也与C3435T连锁，甚至CYP3A家族基因表达受到C3435T的影响。不同种族，不同人群的单体型不相同，导致单个SNP分析结果出现偏差
因此，同关于地高辛的研究相似，这些影响因素的作用可以掩盖甚至扭曲C3435T基因型与环孢素血药浓度的关系，因此有必要对环孢素药代动力学的遗传因素做进一步的研究。
