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        【原创】实验方法分享:用某品牌rProtein A填料有效纯化小鼠腹水单抗

        丁香园论坛

        2955
        很多免疫教科书上描述,人和兔子,还有猪的抗体可以用proteinA亲和纯化。小鼠腹水单抗用protein G亲和介质进行纯化。

        但是在实际科研中,我们发现用新的rProtein A也可以对小鼠腹水进行有效纯化
        我和不少人说起过这个事,但是还是有很多怀疑和种种疑问

        挑战经典理论确实是件难事

        我摘抄了实验室一次实验与大家分享,希望对大家有所帮助

        简单的实验步骤,适合没有层析仪,又希望快速得到抗体的实验室(此次纯化实验耗时约2小时):
        1,用binding buffer(PBS+1M NaCL,pH7.5-8) 的缓冲液置换0.3ml该品牌rProteinA填料的storage buffer。
        2,用binding buffer等体积稀释小鼠腹水1ml(15ml离心管),10000RPM离心15分钟
        3,取离心上清,把步骤1中的填料加入,室温在摇床上晃匀5-60分钟(时间越长,温度37度,能提高抗体和填料的结合率,此次实验中就晃了5分钟,导致流穿中还有一点点抗体残留;)
        4,3-5000RPM离心1-3分钟,沉降填料,吸去上清(流穿)
        5,加入10倍体积的PBS,晃匀,离心,去上清
        6,重复步骤5,注意吸干净残留的PBS
        7,加入1ml洗脱液(柠檬酸pH2.5-3),3-5000RPM离心1-3分钟,沉降填料,吸取上清(洗脱1)到预先加好相应比例的中和液(1M tris-HCL pH 9.0/抗体:中和液=9:1加入)
        8,加入2ml洗脱液(柠檬酸pH2.5-3),3-5000RPM离心1-3分钟,沉降填料,吸取上清(洗脱2)到预先加好相应比例的中和液(1M tris-HCL pH 9.0/抗体:中和液=9:1加入)
        9,加入1ml洗脱液(柠檬酸pH2.5-3),3-5000RPM离心1-3分钟,沉降填料,吸取上清(洗脱3)到预先加好相应比例的中和液(1M tris-HCL pH 9.0/抗体:中和液=9:1加入)
        10,加入1ml洗脱液(柠檬酸pH2.5-3),3-5000RPM离心1-3分钟,沉降填料,吸取上清(洗脱4)到预先加好相应比例的中和液(1M tris-HCL pH 9.0/抗体:中和液=9:1加入)
        11,加入5ml洗脱液(柠檬酸pH2.5-3),3-5000RPM离心1-3分钟,沉降填料,吸取上清(洗脱5)到预先加好相应比例的中和液(1M tris-HCL pH 9.0/抗体:中和液=9:1加入)

        另外说一下proteinA对于proteinG的优点:
        1,A载量高(实际应用中达到15-30mg/ml gel,proteinG一般只有5-10mg/ml)
        2,容易洗脱,也更温和(pH3-4)
        3,价格便宜(我们实验室用的这个牌子进口的rProteinA只要几百块钱一毫升)
        时代在进步,实验技术也在进步:P

        实验结果,见附件

        更多的抗体讨论见该帖子:http://protein.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=16483383&sty=1&tpg=1&age=0
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