【公告】Cytonacx 和癌症的基因治疗
丁香园论坛
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Cytonacx： RNTein Biotech Lab.生物高科技领域内分子医学治疗的最新应用产品
RNTein Biotech Lab.郑重宣布Cytonacx的诞生。该产品是一种新型的非病毒纳米颗粒，其大小在80-200 nm。这种新型颗粒对细胞或组织具有很高的亲合性，但没有病毒基因成份所存在的潜在危害。Cytonacx最基本的功能就是高效率地对细胞实施基因转导（Transduction）这样的分子生物学改造。可以想象，这种具有壳膜结构的生物纳米颗粒，通过与细胞表面的受体相结合，进而发生生物膜融合，将所携带的DNA、微小干扰性RNA（siRNA），蛋白质或多肽等各种形式的分子生物制品安全地放入需要“治疗”的细胞内。更引人注目的一点是，Cytonacx可以在无细胞环境里组装而成，因而能够高质量、大规模进行制备。
经过PEG表面修饰后，Cytonacx充分展示其独特的性能，对机体产生损害的风险极低或无风险，转入基因可以持续性发生效应，因而在基因治疗的应用中克服病毒载体或脂质体所存在的缺陷。如今，RNTein Biotech Lab.已经制成几种Cytonacx，携带特殊的DNA用于治疗诸如癌症、AIDS等疾病。
I:Cytonacx/CDC6 shRNA 抑制癌细胞增殖
在过去的数十年里，癌症的生物学研究取得了重要进展，癌症的诊断和治疗也随之有很大发展。但是，将实验室里研究出的重要结果应用到临床治疗其速度却慢如蜗牛爬行。怎样将生物大分子治疗药物成功地递送到特异的癌组织和细胞里，同时又不对机体产生损害作用，一直是个难题。
研究表明，肿瘤组织里毛细血管壁犹如筛孔洞开，而淋巴回流途径不畅，极易堵塞，此所谓肿瘤组织的增强性通透和淤滞（enhanced permeability and retention, EPR）。由于血管内皮细胞之间的空隙相对增大，就有可能使得肿瘤组织得到较多的大分子治疗药物，而淋巴回流不畅又使这些治疗药物在肿瘤组织里相对聚积更多和更长时间，因此有可能起到特殊治疗效果（Matsumura and Maeda, 1986）。
携带能够产生CDC6 shRNA的Cytonacx有可能成功地用于人的癌症的治疗。癌细胞的增殖依赖Cdc6。用CDC6 shRNA消除Cdc6，使各种培养的人的癌细胞发生细胞雕亡，或衰落。以Cytonacx方式攻击体内癌细胞有其特殊优势：癌组织内血管内皮细胞之间缝隙较之正常的明显增大，加上癌组织的淋巴回流较易发生阻塞，因而使Cytonacx生物纳米颗粒相对地积聚于癌病灶内或其周围，产生特殊的治疗作用。
人的Cdc6是一种酵母DNA复制蛋白质的同源体，在真核细胞内高度保守，为必需蛋白质。用CDC6微小RNA将细胞内的CDC6 mRNA清除，造成Cdc6蛋白质缺失，能使人的肝癌细胞系，宫颈癌HeLa细胞发生细胞凋亡。我们用能够产生短发夹型CDC6 shRNA的逆转录病毒感染人的神经母细胞瘤，将Cdc6蛋白质消除，使得瘤细胞发生细胞凋亡（Feng, et al., 2008）。在我们最近的研究中，用CDC6 shRNA的逆转录病毒感染人的乳腺癌MCF7细胞，使癌细胞发生了增殖衰落（senescence）(Feng, et al., 2008, 未发表论文)。
Cdc6蛋白质在人的细胞内随不同生物活动变化多端。高水平Cdc6增加对p14肿瘤抑制蛋白质染色体基因调控区（RDp14）染色质固缩（Heterochromatinization）。Cdc6水平增高还与人的癌细胞增殖有关（Gonzalez, et al., 2005）。研究发现，在肿瘤抑制蛋白质p53缺失的细胞内，消除Cdc6可造成细胞周期G1细胞群增加，而S期细胞群体下降，表明细胞增殖周期被抑制（Duursma and Agami, 2005）。
我们知道，在一半的人的肿瘤中，肿瘤抑制蛋白质p53不是出现突变，就是功能异常。很多人的肿瘤细胞不能对DNA损伤进行正常修复，而且细胞周期在DNA损伤时也不会被阻断，有DNA损伤的细胞又很少发生细胞自身死亡（Bartkova et al., 2005）。由于p53功能缺失，再加上Cdc6被细胞周期因子E和细胞周期因子依赖性蛋白磷酸化激酶2（CyclinE-cdk2 kinase）对其氨基末端的磷酸化，使得Cdc6在癌细胞中更趋于稳定（Mailand and Diffley, 2005）。这样一来，Cdc6借助cyclinE-cdk2 蛋白磷酸化激酶驱使，如发疯似地让癌细胞不停顿地增殖。将Cdc6在这些癌细胞里清除，就能够使其丧失增殖能力。因此，Cytonacx/CDC6 shRNA用于人的癌症的治疗将产生良好的效果。
II:Cytonacx/FEN-1-D181A抑制HIV-1病毒感染
一种特殊的人的核酸内切酶FEN-1参与HIV-1病毒在被感染的细胞内复制。FEN-1的突变蛋白质D181A被证实能够有效地阻止HIV-1病毒复制。尽管D181A在试管的实验中对FEN-1内切酶功能有明显抑制作用（Shen et al., 1997），但细胞生长并没有因D181A的存在而受到损害，而这些细胞对HIV-1病毒感染却产生了有效的抵抗作用（Feng et al., 2004，未发表论文）。Cytonacx/FEN-1-D181A正是依据这样的事实而设计用来治疗AIDS患者的。它的壳膜是用改造的HIV-1 GP120制备的，因而能够识别人的CD4受体阳性的细胞。Cytonacx/FEN-1-D181A还可以用来对人的造血干细胞进行基因工程改造，用于持续性抗HIV-1病毒感染的治疗。
HIV-1 感染CD4受体阳性的血液或淋巴细胞，并造成这些细胞的萎缩消失。在HIV-1感染过程中，HIV-1 cDNA形成中央DNA折叠片（central DNA flap）。HIV-1的中央DNA折叠片被证实是HIV-1整合复合物（PIC）向核内迁移的中心成份（Zennou et al., 2000）。然而，中央DNA折叠片只有被切除修复后HIV-1才能完成病毒感染过程。至今尚无HIV-1病毒蛋白被证实可以完成这一使命。
HIV-1中央DNA折叠片具有一种称之为1型折叠片内切酶（FEN-1）作用底物的所有结构特征。FEN-1是一种细胞内DNA核酸酶，基因工程重组的FEN-1能够切除寡聚核苷酸形成的HIV-1折叠片（Rumbaugh et al., 1998）。不仅如此，这种基因工程重组的FEN-1还能够切除HIV-1 cDNA两个5’末端伸出的核苷酸残体（Brin et al., 2000）。这些研究结果说明，人的FEN-1在体内很有能参与HIV-1中央DNA折叠片的切除过程。
研究发现，FEN-1蛋白质里第181位的天门东氨酸（Asp）突变为丙氨酸（Ala）（FEN-1 D181A），在HIV-1感染过程中不能切除中央DNA折叠片（Feng et al., 2004，未发表论文）。D181A是FEN-1的显性抑制突变蛋白质，失去96%以上的FEN-1折叠片内切酶功能，并抑制FEN-1的内切酶功能。由于D181A不能切除中央DNA折叠片，HIV-1病毒无法完成复制，从而有效地抑制了HIV-1对细胞的感染。细胞有了D181A后，并没有因为FEN-1的功能被抑制而发生异常，更重要的是这些细胞对HIV-1的感染产生了有效的抵抗作功能。
抗AIDS研究重点是开发那些能够阻止HIV-1病毒蛋白质功能的制剂。但这些抑制物只针对HIV-1病毒中那些对病毒复制至关重要的病毒本身产生的蛋白，而这些病毒蛋白质极易发生突变，从而产生抗药性。如果我们针对象FEN-1这样的来自细胞本身的蛋白质而开发抑制HIV-1制剂，遇到抗药性的机会将很小。Cytonacx/FEN-1-D181A正是这样的抗HIV-1的制剂。这种生物纳米颗粒将以HIV-1病毒本身的壳膜蛋白质gp120经基因工程改造而选择特异的CD4受体阳性细胞，并将其转导（Transduction）为D181A形式。在不远的将来，我们还将对人的造血干细胞用Cytonacx/FEN-1-D181A进行转导，使其进行不断增殖，持续产生抗HIV-1感染的作用。
参考文献：
Bartkova J, Horejsi Z, Koed K, Kramer A, Tort F, Zieger K, Guldberg P, Sehested M, Nesland JM, Lukas C, Orntoft T, Lukas J, Bartek J (2005) DNA damage response as a candidate anticancer barrier in early human tumorigenesis. Nature 434:864–870.
Brin E, Yi J, Skalka AM, Leis J (2000) Modeling the late steps in HIV-1 retroviral integrase-catalyzed DNA integration. J. Biol. Chem. 275:39287-39295.
Duursma A, Agami R (2005) p53-dependent regulation of Cdc6 protein stability controls cellular proliferation. Mol. Cell. Biol. 25:6937–6947.
Feng L, Barnhart JR, Seeger RC, Wu L, Keshelava N, Huang SH, Jong A (2008) Cdc6 knockdown inhibits human neuroblastoma cell proliferation. Mol. Cell. Biochem. 311:189-197.
Gonzalez S, Klatt P, Delgado S, Conde E, Lopez-Rios F, Sanchez-Cespedes M, Mendez J, Antequera F, Serrano M (2006) Oncogenic activity of Cdc6 through repression of the INK4/ARF locus. Nature 440:702–706.
Mailand N, Diffley JF (2005) CDKs promote DNA replication origin licensing in human cells by protecting Cdc6 from APC/Cdependent proteolysis. Cell 122:915–926.
Matsumura y, Maeda H (1986) A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent
SMANCS. Cancer Res. 46:6387–6392.
Rumbaugh JA, Fuentes GM, Bambara RA (1998) Processing of an HIV replication intermediate by the human DNA replication enzyme FEN1. J. Biol. Chem. 273:28740-28745.
Shen BH, Nolan JP, Sklar LA, Park MS (1997) Functional analysis of point mutations in human flap endonuclease-1 active site. Nucleic Acids Res. 25:3332-3338.
Zennou V, Petit C, Guetard D, Nerhbass U, Montagnier L, Charneau P (2000) HIV-1 genome nuclear import is mediated by a central DNA flap. Cell 101:173-185.
Contact us:
RNTein Biotech. Lab.
Dedicated to human cancer gene therapy
416 W. Las Tunas Drive, Suite 106
San Gabriel, California 91776
USA
www.rntein.com
Phone: (626) 282-0577
E-mail: fengluofeng@aol.com
RNTein Biotech Lab.郑重宣布Cytonacx的诞生。该产品是一种新型的非病毒纳米颗粒，其大小在80-200 nm。这种新型颗粒对细胞或组织具有很高的亲合性，但没有病毒基因成份所存在的潜在危害。Cytonacx最基本的功能就是高效率地对细胞实施基因转导（Transduction）这样的分子生物学改造。可以想象，这种具有壳膜结构的生物纳米颗粒，通过与细胞表面的受体相结合，进而发生生物膜融合，将所携带的DNA、微小干扰性RNA（siRNA），蛋白质或多肽等各种形式的分子生物制品安全地放入需要“治疗”的细胞内。更引人注目的一点是，Cytonacx可以在无细胞环境里组装而成，因而能够高质量、大规模进行制备。
经过PEG表面修饰后，Cytonacx充分展示其独特的性能，对机体产生损害的风险极低或无风险，转入基因可以持续性发生效应，因而在基因治疗的应用中克服病毒载体或脂质体所存在的缺陷。如今，RNTein Biotech Lab.已经制成几种Cytonacx，携带特殊的DNA用于治疗诸如癌症、AIDS等疾病。
I:Cytonacx/CDC6 shRNA 抑制癌细胞增殖
在过去的数十年里，癌症的生物学研究取得了重要进展，癌症的诊断和治疗也随之有很大发展。但是，将实验室里研究出的重要结果应用到临床治疗其速度却慢如蜗牛爬行。怎样将生物大分子治疗药物成功地递送到特异的癌组织和细胞里，同时又不对机体产生损害作用，一直是个难题。
研究表明，肿瘤组织里毛细血管壁犹如筛孔洞开，而淋巴回流途径不畅，极易堵塞，此所谓肿瘤组织的增强性通透和淤滞（enhanced permeability and retention, EPR）。由于血管内皮细胞之间的空隙相对增大，就有可能使得肿瘤组织得到较多的大分子治疗药物，而淋巴回流不畅又使这些治疗药物在肿瘤组织里相对聚积更多和更长时间，因此有可能起到特殊治疗效果（Matsumura and Maeda, 1986）。
携带能够产生CDC6 shRNA的Cytonacx有可能成功地用于人的癌症的治疗。癌细胞的增殖依赖Cdc6。用CDC6 shRNA消除Cdc6，使各种培养的人的癌细胞发生细胞雕亡，或衰落。以Cytonacx方式攻击体内癌细胞有其特殊优势：癌组织内血管内皮细胞之间缝隙较之正常的明显增大，加上癌组织的淋巴回流较易发生阻塞，因而使Cytonacx生物纳米颗粒相对地积聚于癌病灶内或其周围，产生特殊的治疗作用。
人的Cdc6是一种酵母DNA复制蛋白质的同源体，在真核细胞内高度保守，为必需蛋白质。用CDC6微小RNA将细胞内的CDC6 mRNA清除，造成Cdc6蛋白质缺失，能使人的肝癌细胞系，宫颈癌HeLa细胞发生细胞凋亡。我们用能够产生短发夹型CDC6 shRNA的逆转录病毒感染人的神经母细胞瘤，将Cdc6蛋白质消除，使得瘤细胞发生细胞凋亡（Feng, et al., 2008）。在我们最近的研究中，用CDC6 shRNA的逆转录病毒感染人的乳腺癌MCF7细胞，使癌细胞发生了增殖衰落（senescence）(Feng, et al., 2008, 未发表论文)。
Cdc6蛋白质在人的细胞内随不同生物活动变化多端。高水平Cdc6增加对p14肿瘤抑制蛋白质染色体基因调控区（RDp14）染色质固缩（Heterochromatinization）。Cdc6水平增高还与人的癌细胞增殖有关（Gonzalez, et al., 2005）。研究发现，在肿瘤抑制蛋白质p53缺失的细胞内，消除Cdc6可造成细胞周期G1细胞群增加，而S期细胞群体下降，表明细胞增殖周期被抑制（Duursma and Agami, 2005）。
我们知道，在一半的人的肿瘤中，肿瘤抑制蛋白质p53不是出现突变，就是功能异常。很多人的肿瘤细胞不能对DNA损伤进行正常修复，而且细胞周期在DNA损伤时也不会被阻断，有DNA损伤的细胞又很少发生细胞自身死亡（Bartkova et al., 2005）。由于p53功能缺失，再加上Cdc6被细胞周期因子E和细胞周期因子依赖性蛋白磷酸化激酶2（CyclinE-cdk2 kinase）对其氨基末端的磷酸化，使得Cdc6在癌细胞中更趋于稳定（Mailand and Diffley, 2005）。这样一来，Cdc6借助cyclinE-cdk2 蛋白磷酸化激酶驱使，如发疯似地让癌细胞不停顿地增殖。将Cdc6在这些癌细胞里清除，就能够使其丧失增殖能力。因此，Cytonacx/CDC6 shRNA用于人的癌症的治疗将产生良好的效果。
II:Cytonacx/FEN-1-D181A抑制HIV-1病毒感染
一种特殊的人的核酸内切酶FEN-1参与HIV-1病毒在被感染的细胞内复制。FEN-1的突变蛋白质D181A被证实能够有效地阻止HIV-1病毒复制。尽管D181A在试管的实验中对FEN-1内切酶功能有明显抑制作用（Shen et al., 1997），但细胞生长并没有因D181A的存在而受到损害，而这些细胞对HIV-1病毒感染却产生了有效的抵抗作用（Feng et al., 2004，未发表论文）。Cytonacx/FEN-1-D181A正是依据这样的事实而设计用来治疗AIDS患者的。它的壳膜是用改造的HIV-1 GP120制备的，因而能够识别人的CD4受体阳性的细胞。Cytonacx/FEN-1-D181A还可以用来对人的造血干细胞进行基因工程改造，用于持续性抗HIV-1病毒感染的治疗。
HIV-1 感染CD4受体阳性的血液或淋巴细胞，并造成这些细胞的萎缩消失。在HIV-1感染过程中，HIV-1 cDNA形成中央DNA折叠片（central DNA flap）。HIV-1的中央DNA折叠片被证实是HIV-1整合复合物（PIC）向核内迁移的中心成份（Zennou et al., 2000）。然而，中央DNA折叠片只有被切除修复后HIV-1才能完成病毒感染过程。至今尚无HIV-1病毒蛋白被证实可以完成这一使命。
HIV-1中央DNA折叠片具有一种称之为1型折叠片内切酶（FEN-1）作用底物的所有结构特征。FEN-1是一种细胞内DNA核酸酶，基因工程重组的FEN-1能够切除寡聚核苷酸形成的HIV-1折叠片（Rumbaugh et al., 1998）。不仅如此，这种基因工程重组的FEN-1还能够切除HIV-1 cDNA两个5’末端伸出的核苷酸残体（Brin et al., 2000）。这些研究结果说明，人的FEN-1在体内很有能参与HIV-1中央DNA折叠片的切除过程。
研究发现，FEN-1蛋白质里第181位的天门东氨酸（Asp）突变为丙氨酸（Ala）（FEN-1 D181A），在HIV-1感染过程中不能切除中央DNA折叠片（Feng et al., 2004，未发表论文）。D181A是FEN-1的显性抑制突变蛋白质，失去96%以上的FEN-1折叠片内切酶功能，并抑制FEN-1的内切酶功能。由于D181A不能切除中央DNA折叠片，HIV-1病毒无法完成复制，从而有效地抑制了HIV-1对细胞的感染。细胞有了D181A后，并没有因为FEN-1的功能被抑制而发生异常，更重要的是这些细胞对HIV-1的感染产生了有效的抵抗作功能。
抗AIDS研究重点是开发那些能够阻止HIV-1病毒蛋白质功能的制剂。但这些抑制物只针对HIV-1病毒中那些对病毒复制至关重要的病毒本身产生的蛋白，而这些病毒蛋白质极易发生突变，从而产生抗药性。如果我们针对象FEN-1这样的来自细胞本身的蛋白质而开发抑制HIV-1制剂，遇到抗药性的机会将很小。Cytonacx/FEN-1-D181A正是这样的抗HIV-1的制剂。这种生物纳米颗粒将以HIV-1病毒本身的壳膜蛋白质gp120经基因工程改造而选择特异的CD4受体阳性细胞，并将其转导（Transduction）为D181A形式。在不远的将来，我们还将对人的造血干细胞用Cytonacx/FEN-1-D181A进行转导，使其进行不断增殖，持续产生抗HIV-1感染的作用。
参考文献：
Bartkova J, Horejsi Z, Koed K, Kramer A, Tort F, Zieger K, Guldberg P, Sehested M, Nesland JM, Lukas C, Orntoft T, Lukas J, Bartek J (2005) DNA damage response as a candidate anticancer barrier in early human tumorigenesis. Nature 434:864–870.
Brin E, Yi J, Skalka AM, Leis J (2000) Modeling the late steps in HIV-1 retroviral integrase-catalyzed DNA integration. J. Biol. Chem. 275:39287-39295.
Duursma A, Agami R (2005) p53-dependent regulation of Cdc6 protein stability controls cellular proliferation. Mol. Cell. Biol. 25:6937–6947.
Feng L, Barnhart JR, Seeger RC, Wu L, Keshelava N, Huang SH, Jong A (2008) Cdc6 knockdown inhibits human neuroblastoma cell proliferation. Mol. Cell. Biochem. 311:189-197.
Gonzalez S, Klatt P, Delgado S, Conde E, Lopez-Rios F, Sanchez-Cespedes M, Mendez J, Antequera F, Serrano M (2006) Oncogenic activity of Cdc6 through repression of the INK4/ARF locus. Nature 440:702–706.
Mailand N, Diffley JF (2005) CDKs promote DNA replication origin licensing in human cells by protecting Cdc6 from APC/Cdependent proteolysis. Cell 122:915–926.
Matsumura y, Maeda H (1986) A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent
SMANCS. Cancer Res. 46:6387–6392.
Rumbaugh JA, Fuentes GM, Bambara RA (1998) Processing of an HIV replication intermediate by the human DNA replication enzyme FEN1. J. Biol. Chem. 273:28740-28745.
Shen BH, Nolan JP, Sklar LA, Park MS (1997) Functional analysis of point mutations in human flap endonuclease-1 active site. Nucleic Acids Res. 25:3332-3338.
Zennou V, Petit C, Guetard D, Nerhbass U, Montagnier L, Charneau P (2000) HIV-1 genome nuclear import is mediated by a central DNA flap. Cell 101:173-185.
Contact us:
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Dedicated to human cancer gene therapy
416 W. Las Tunas Drive, Suite 106
San Gabriel, California 91776
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E-mail: fengluofeng@aol.com
