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        【求助】QPCR标准曲线标准品及内参基因NADPH

        丁香园论坛

        8691
        求助:
        我想做一个QPCR检测肝癌组织及正常组织的一个基因表达,我是用哪个做标准品建立标准曲线;另外关于人的内参NAPDH的引物序列,不同文献不同,我应该怎样选择。谢谢
        你要做绝对定量还是相对定量?
        既然你提取用内参,那应该就是相对定量了
        所以不需要标准品做标准曲线。但你需要对你的两对引物进行扩增效率测试
        也是10倍稀释,就拿cDNA即可。
        如果两个梯度间的Ct值差异刚好是3.326,就非常好了,达到100%的扩增效率。
        GAPDH看家基因,每个实验室应该都有现成的。随便哪个都行,但请注意,扩增产物长度
        最好跟你的目的基因类似,退火温度也一致。
        两对引物进行扩增效率测试是做什么用呢?
        这是相对定量计算公式的假设之一。
        两对引物的扩增效率是相同的。
        就是绝对定量里那个Ct=-y(e)logXo+x(e)么?看了网上的一些资料,我一直没明白相对定量是怎么回事,内参和目的基因的扩增系数本就不可能相同啊。。。
        内参和目的基因的扩增系数尽量一样,才可以用delta delta法直接进行计算,如图
        但并非lz上所说的,扩增系数不可能相同。
        一个循环2倍扩增,还是很容易实现的。怎么会不可能相同呢?
        【求助】QPCR标准曲线标准品及内参基因NADPH
        然而有些情况,两个基因的扩增效果不同。如果差异比较小,可以考虑用公式进行修正。如下图:
        如果差异非常大,我个人是不建议用公式修正的,因为一定是引物设计的不好,或者条件不对,扩增效率在90%以下的,或者在110%以上,都建议重新设计引物。因为扩增效率肯定不正确,用修正公式会误导。
        【求助】QPCR标准曲线标准品及内参基因NADPH
        哇~~~昨天刚收藏了你的一篇关于可变剪切的文章,非常感谢,学习了.
        昨天又看了一篇关于两对primer的预实验看e是否相同,个人理解是不是我的待测样品并不需要知道浓度的情况下,与参照基因一起稀释以各种倍数进行稀释,让后进行q-RT-PCR,如果不论什么稀释倍数,它们俩总是deltaCt相同就说明问题?
        前辈的第二章图是用Ct对稀释倍数做图的吧?

        本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

        师兄微信号:shixiongcoming

        【求助】QPCR标准曲线标准品及内参基因NADPH

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