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        【求助】转染后Western不出结果可能会有什么原因

        丁香园论坛

        3911
        我刚做的瞬转,转染效率在80%,希望通过Western看一下表达结果(应该为高表达),有未转染的细胞(应有这种蛋白)作对照。
        结果未转染的细胞有表达,转染的细胞都没有表达,且ß-actin均有表达。
        求助各位高手,可能有什么原因,非常感谢
        上样的总蛋白已经定量过了?
        每个样做了几个复孔?
        这个试验重复了几次?
        该蛋白是否本底表达水平过高?
        上样蛋白为四个孔,为两个样分别有两个复孔,每孔定量为20ug,重复了两次。
        最后一个问题没看懂,谢谢!!
        未转染的细胞有表达,转染的细胞都没有表达?
        你是不是把样品搞混了
        未转染细胞应该有表达,转染后应该为高表达。
        sissiwubing wrote:
        我刚做的瞬转,转染效率在80%,希望通过Western看一下表达结果(应该为高表达),有未转染的细胞(应有这种蛋白)作对照。
        结果未转染的细胞有表达,转染的细胞都没有表达,且ß-actin均有表达。
        求助各位高手,可能有什么原因,非常感谢

        怎么听上去像siRNA or shRNA的转染结果,你确定你用的质粒是正确无误的?
        质粒肯定是没问题的。
        你的那个转染效率80%怎么得到的。转染的效果主要看标签蛋白的表达情况,然后再看目的基因,你没有提供标签蛋白的表达情况,这种结果只能凭空猜想了
        不建议推荐此贴。
        楼主根本没把事情完全说清楚,而且我觉的实验设计还稍有问题
        1.转染的时候,为何没有空载体的转染?
        2.转染后的80%效率是如何算出来的?标签蛋白是什么?一般来说是GFP,那在荧光显微镜下能看到绿色荧光吗?
        3.建议先做real time PCR,从RNA水平鉴定有没有转染?如果有空载体,那很容易对比出来。
        4.你说质粒绝对无问题,如何能肯定?如果在移码突变,那就表达不了。
        5.综合来看:你的实验设计不妥,没有空载体;其次,怎么会没有标签蛋白的?real time有检测过吗?
        最后,你的表述很不清楚。发的贴子是让大家来猜你的错误。

        所以推荐此贴意义不大。大家都在瞎猜中
        zjubell wrote:
        不建议推荐此贴。
        楼主根本没把事情完全说清楚,而且我觉的实验设计还稍有问题
        1.转染的时候,为何没有空载体的转染?
        2.转染后的80%效率是如何算出来的?标签蛋白是什么?一般来说是GFP,那在荧光显微镜下能看到绿色荧光吗?
        3.建议先做real time PCR,从RNA水平鉴定有没有转染?如果有空载体,那很容易对比出来。
        4.你说质粒绝对无问题,如何能肯定?如果在移码突变,那就表达不了。
        5.综合来看:你的实验设计不妥,没有空载体;其次,怎么会没有标签蛋白的?real time有检测过吗?
        最后,你的表述很不清楚。发的贴子是让大家来猜你的错误。

        所以推荐此贴意义不大。大家都在瞎猜中

        严重同意!!楼上高手啊!

        本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

        师兄微信号:shixiongcoming

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