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        常用免疫组化染色方法

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        如何实现完美的免疫组化实验

        (一)、ABC法:( 注,下面各种方法,均为手工操作,如没特别说明,均在室温下进行)

        1.切片经二甲苯Ⅰ 5分钟。

        2.切片经二甲苯Ⅱ 5分钟。

        3. 无水酒精Ⅰ 30秒。

        4. 无水酒精Ⅱ 30秒。

        5. 95%酒精Ⅰ 30秒。

        6. 95%酒精Ⅱ 30秒。

        7. 90%酒精 30秒。

        8.80%酒精 30秒。

        9. 70%酒精 30秒。

        10.自来水洗。(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)

        11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。

        12.水洗。

        13.抗原 修复。

        14.PBS 洗3次,1分钟/次。

        15.加入血清孵育20分钟。

        16.摔干血清,加入一抗60分钟。

        17.PBS洗3次,2分钟/次。

        18.加入二抗孵育30分钟。

        19.PBS洗3次,2分钟/次。

        20.加入ABC复合物,孵育30分钟。

        21. PBS洗3次,2分钟/次。

        22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。

        23.PBS洗,水洗。

        24.Harris苏木素染核5-10分钟。

        25.水洗,分化,蓝化,脱水,透明并封固。

        (二)、LSAB法。(SP法)(Labelled streptavidim biotln)

        1.切片脱蜡至水。

        2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。

        3.水洗。

        4.抗原修复。

        5.PBS洗3次,1分钟/次。

        6.加入血清孵育10分钟。

        7.摔去血清,加入一抗孵育30-60分钟。

        8.PBS洗3次,每次2分钟。加入二抗,孵育20分钟。

        9.PBS洗3次,每次2分钟。

        10.加入SP复合物孵育20-30分钟。

        11.PBS洗3次,每次2分钟。

        12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。

        13.PBS洗,水洗。

        14.Harris苏木素染核5-10分钟。

        15.水洗,分化 ,蓝化,脱水,透明并封固。

        (三)真空负压LSAB法

        1.切片脱蜡至水。

        2. 0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.

        3. 水洗。

        4.如果需要,可进行抗原修复。

        5.PBS洗3次,每次1分钟。

        6.加入正常血清真空负压处理5min。

        7.摔干血清,加入第一抗体,真空负压处理5分钟。

        8. PBS洗3次,每次2分钟。

        9. 加入二抗(即连接抗体)真空负压处理5分钟。

        10.PBS洗3次,每次2分钟。

        11.加入链卵蛋白复合物,真空负压处理 5分钟。

        12.PBS洗3次,每次2分钟。

        13.DAB-H2O2孵育5-10分钟。

        14.PBS洗,水洗。

        15.染核,分化,蓝化,脱水,透明并封固。

        注:真空负压即将真空干燥中抽成真空。负压达66.7KPa(500mmHg)

        (四)Envision TM Systems.

        1.切片脱蜡至水。

        2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

        3.水洗。

        4.抗原修复。

        5.PBS洗3次,每次1分钟。

        6.加入一抗体孵育30-60分钟。

        7.PBS洗3次,每次2分钟。

        8.加入增强剂孵育20-30分钟。

        9.PBS洗3次,每次2分钟。

        10.加入酶标抗兔/鼠,复合物,孵育20-30分钟。

        11.PBS洗3次,每次2分钟。

        12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。

        13.PBS洗,水洗。

        14.Harris苏木素染核5-10分钟。

        15.水洗,分化,蓝化,脱水,透明并封固。

        (五)免疫组化 双染色法。(ⅰ) (Ionmuno-Histochemistry double staimimg method)

        1.切片脱蜡至水。

        2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

        3.水洗。

        4.抗原修复。

        5.PBS洗3次,每次1分钟。

        6.加入非免疫性动物血清,孵育10分钟。

        7.PBS洗3次,每次2分钟。

        8.加入第一抗体孵育60分钟。

        9.PBS洗3次,每次2分钟。

        10.加入生物素化的第二抗体,孵育10分钟。

        11.PBS洗3次,每次2分钟。

        12.加入链卵蛋白素过氧化物酶孵育10分钟。

        13.PBS洗3次,每次2分钟。

        14.加入DAB-H2O2孵育5-10分钟。

        15.PBS洗3次,每次2分钟。

        16. 加入双染增强液,孵育10分钟。

        17. 加入非免疫性动物血清孵育10分钟。

        18. PBS洗3次,每次2分钟。

        19. 加入选用的第二种抗体孵育60分钟。

        20. PBS洗3次,每次2分钟。

        21. 加入生物素标记的第二抗体孵育10分钟。

        22. PBS洗3次,每次2 分钟。

        23. 加入链卵蛋白素碱性磷酸酶孵育10分钟。

        24. PBS洗3次,每次2分钟。

        25. 加入AEC溶液,孵育5-10分钟。

        26. 自来水洗。

        27. 苏木素染核5-10分钟。

        28. 水性封片。

        注:1.第一种复合物也可先用链卵蛋白素碱性磷酸酶。

        2.第1次显色也可用BCIP/NBT溶液,颜色为蓝黑色,但应与苏木素鉴别。

        (六)、免疫组化的双染色法(ⅱ) (Immuno-histochemistry double staining method)

        1.切片脱蜡至水。

        2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

        3.水洗。

        4.抗原修复。

        5.PBS洗3次,每次1分钟。

        6.加入选用的第一抗体孵育30-60分钟。

        7.PBS洗3次,每次2分钟。

        8.加入增强剂孵育20-30分钟。

        9.PBS洗3次,每次2分钟。

        10.加入酶标抗兔/鼠,复合物,孵育

        11.PBS洗3次,每次2分钟。

        12.加入DAB-H2O2孵育5-10分钟

        13.PBS洗3次,每次2分钟。

        14.加入选用的第二种抗体孵育60分钟。

        15.PBS洗3次,每次2分钟。

        16. 加入增强剂孵育20-30分钟。

        17. PBS洗3次,每次2分钟。

        18. 加入酶标抗兔/鼠碱性磷酸酶复合物孵育20-30分钟。

        19.PBS洗3次,每次2分钟。

        20.加入AEC溶液孵育5-10分钟。

        21.自来水洗。

        22.苏木素染核5-10分钟。

        23.水性封片。

        (七)细胞培养片免疫荧光染色法。

        1.将细胞于载片或盖玻片的片子用生理盐水洗几次。

        2.纯丙酮固定10分钟。

        3.PBS浸洗3次,每次1分钟。

        4.加入选用的第一抗体孵育120分钟。

        5.PBS洗3次,每次2分钟。

        6.加入荧光抗体孵育60分钟以上。

        7.PBS法3次,每次2分钟。

        8.0.1%伊文氏蓝衬染3分钟。

        9.水洗,蒸馏水洗。

        10. 水性胶封片或用缓冲甘油封片。

        (八)真空负压免疫荧光染色法染细胞培养片。

        1. 将细胞爬于载玻片或盖玻片的片子用生理盐水浸洗数次,彻底洗去蛋白液。

        2.纯丙酮固定5-10分钟。

        3.PBS浸洗3次,每次1分钟。

        4.加入选用的第一抗体孵育真空负压处理15分钟。

        5.PBS洗3次,每次2分钟。

        6.加入荧光抗体孵育真空负压处理15分钟。

        7.PBS洗3次,每次2分钟。

        8.0.1%伊文氏蓝衬染3分钟。

        9.水洗,蒸馏水洗。

        10.水性胶封片或用缓冲甘油封片。

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