ISSR分子标记的实验原理及操作流程

ISSR（inter-simple sequence repeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列，由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5’或3’末端结合，导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。

一、实验材料
　　不同来源的DNA(30-50ng/ul)。

二、实验设备
　　PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置，凝胶成像仪。

三、 试剂
　　1、ISSR引物：购买成品或根据加拿大British Columbia大学设计的ISSR引物序列（见附录）自己合成。
　　2、Taq酶
　　3、10xPCR 缓冲液
4、MgCl ₂ ：25mmol/L。
　　5、dNTP：2.5mmol/L。

四、操作步骤 ：
　　1. 在25ul反应体系中，加入
　　　　模板DNA 1ul (30-50ng)
　　　　ISSR引物 1ul (约5pmol)
　　　　10xPCR Buffer 2.5ul
　　　　MgCl ₂ 2ul
　　　　dNTP 2ul
　　　　Taq酶 1单位（U）
　　　　加ddH ₂ O 至 25ul
　　混匀稍离心, 加一滴（约20 ul）矿物油。
　　2. 在 PCR仪 中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 45℃-68℃ 40秒， 72℃ 1-2分钟，共40轮循环。
　　3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。
　　4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于1.6% 或1.8% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100Ｖ（电压低带型整齐， 分辨率高）。
　　5. 电泳结束，溴化乙锭染色20分钟。
6. 用凝胶成像仪观察、拍照。

操作流程简图：