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        全细胞DNA的制备

        互联网

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        全细胞DNA是目的基因的材料来源,因此是必须得到的。我们通过学习细菌的全细胞DNA的制备,来了解DNA制备的基本知识。随后,我们再讲解质粒和噬菌体DNA的制备过程。

        从细菌培养物中制备全细胞DNA的步骤:
        (1)培养细胞的生长和收集(harvested);
        (2)细胞的破碎及内含物(content)的释放;
        (3)从细胞抽提物(cell extract)中除去DNA外的其他所有成分;
        (4)DNA溶液的浓缩(concentrated)。

        细菌培养物的生长和收集
        培养细菌需要培养基(culture medium),M9和LB培养基是两种典型的细菌培养基。
        M9是一种确定成分培养基(defined medium),其中的所有成分是可知的。这种培养基包含的无机营养成分(inorganic nutrients)的混合物为细菌的生长提供基本元素,如氮,镁和钙,葡萄糖(glucose)提供碳源和能量。在实际应用中,还必须向M9中添加额外的生长因子,如微量元素和维生素。需要添加何种成分要视情况而定。
        Luria-Bertani(LB)培养基是一种不确定成分培养基( medium),胰蛋白胨(tryptone)负责提供氨基酸以及小的肽段,酵母提取物(yeast extract)负责提供氮源、糖以及其他有机和无机营养。类似LB的混合培养基不需要补充其他的营养成分,并且能够维持种类更多的细菌的生长。
        当细菌培养物需要在严格准确的条件下进行生长时,必须使用确定成分培养基。然而,当培养物仅仅作为一种DNA的来源时,就没有必要用确定成分培养基,利用不确定成分培养基就更加合适。
        利用LB培养基,在37 ℃、150~250 r/min的条件下,培养大肠杆菌细胞,大约每20 min分裂一次,直到培养基中的细胞达到2×109~3×109个/mL的最大密度。培养物的生长状况可以通过读取600 nm可见分光光度值(OD值)来监测,在该波长下,每个单位的OD值相当于0.8×109 个/mL。
        通过离心可以收集细胞。相对较低的转速就能够使细菌在离心管(centrifuge tube)的底部聚集,这样一来上层的培养基就能够很容易到出。


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