硝酸纤维素膜吸附蛋白的常见问题处理

基于膜的检测试剂研发人员应该严格考虑影响蛋白质在硝酸纤维素膜上结合众多因素，其中包括原材料的固有属性和处理过程等。

随着胶体金标记技术的发展、研发人员对胶体金快速检测技术深入研究，市场上基于膜的快速免疫层析检测产品的种类迅速增多。

虽然免疫层析产品的包装设计种类繁多，实际上目前主流的商品化检测试剂盒主要下面两种形式。最常用的检测形式为侧向层析

或者层析定量，这种检测形式通常应用于诊所或者由直销客户检测。另一种检测形式为竖向斑点渗滤，该检测形式需要较强的操作技巧，仅限于研究使用。

不管试剂采用那种检测形式，灵敏、可重复的检测试剂的生产需要试剂生产商采用有效的途径制备检测线工作液。快速诊断试剂生产商经常对如何优化检测线相关的文章非常感兴趣。这些文章可以有助于研发人员涉及关于蛋白质固着于硝酸纤维素膜基本原理的讨论，并对研发人员在开发免疫层析试剂中面临的常见问题给予强调。由于关于蛋白质吸附于NC膜的问题普遍存在于侧向层析，因此这篇文章重点讨论这方面的问题。

蛋白质吸附的重要性

在免疫层析检测中，蛋白质固着于NC膜作为待测样本的捕获试剂。由于检测结果完全取决于捕获试剂在膜上达到良好的吸附效果，因此蛋白质在膜上均一、良好的吸附对检测结果非常重要。

自从NC膜第一次应用于蛋白质吸附以来，已有相当多的关于蛋白质吸附于NC膜的研究，但蛋白质吸附于NC膜的确切作用机理仍然不能确定。虽然多种作用力在结合中起到作用，尤其比如疏水力、氢键、静电作用，但是每种作用力的重要性和明确的效果仍然让人难以琢磨。目前有两种比较合理的作用模式。第一种模式认为，蛋白质最初通过静电作用被吸附到NC膜表面，而长期的结合作用是通过氢键和疏水作用完成的。虽然这一原理难以证明，但与已发表的文献实验结论一致，也是最为接受的作用机理。

第二种模式认为，蛋白质首先通过疏水相互作用结合到NC膜上，通过静电力牢固地与NC膜结合则。该结合模式同大量已发表的文献结果一致，然而静电作用机理对于采用干燥或乙醇吸附方法到达的蛋白质长期稳定的吸附于NC膜上无法提高合理的解释。

不管蛋白质结合的作用力如何达到平衡，研究人员在优化蛋白质吸附于特定的NC膜时，必须综合考虑所有影响蛋白质吸附的作用力。这一观点不可避免的影响着试纸条板材的选择及其处理工艺。例如，如果产品开发人员选用可以极度降低静电相互作用或者疏水相互作用的缓冲液，那么蛋白质的吸附能力则剧烈的降低。同理，蛋白质点膜后充足地干燥对于确保蛋白质长期稳定地固着于NC膜非常重要。

生产商选用的材料能够有效地将蛋白吸附于NC膜上。影响蛋白质吸附于NC膜的材料通常有3种类型：非特异性的蛋白质、影响静电相互作用以及疏水相互作用的物质。常见的能够降低蛋白质结合的物质包括竞争蛋白质结合位点的其他蛋白，如BSA、动物血清，干扰氢键的形成物质（如甲酰胺、尿素），影响疏水作用形成的物质（如Tween、Triton、Brij）。人工合成的结合物比如聚乙烯醇、聚乙二醇以及聚乙烯吡咯烷酮也可以影响蛋白质的结合，它们的作用机理可能是抑制一个或者多个蛋白质与NC膜结合的共同作用的结果。

如果NC膜上结合的蛋白量不足或者蛋白结合力不够强，就会出现相当多的问题，在检测结果的检测线上非常明显（。如果膜上结合的蛋白量太低，那么在结果中检测线显色较弱而且检测灵敏度降低。如果蛋白不能牢固的吸附于NC膜，那么在蛋白吸附于NC膜以前发生扩散，从而导致检测线较宽、显色较弱而不是鲜艳而清晰，使检测结果难以解释。在极端条件下，如果蛋白与NC膜的物理吸附作用太弱，流过的蛋白检测物和表面活性剂溶液可能将固着的蛋白从NC膜上洗掉，从而显示较宽或者根本不清晰的检测线，难以解释检测结果。

体外诊断试剂研发人员经常遇到上述问题，而且这些问题明显地延长了免疫层析检测试剂的研发周期。为了了解如何解决上述问题，研究人员首先应该牢固的掌握影响蛋白与NC膜结合的各种因素，包括材料的固有属性及其检测前的处理过程。本文的第一部分就这些问题进行讨论，第二部分主要介绍在技术上如何解决这些问题（待发表于IVD技术杂志）。

影响蛋白质吸附的因素

当研究蛋白质捕获剂结合于NC膜时，研发人员应该考虑下面五个影响蛋白质结合作用机理的每一个关键因素。

Ø 溶解捕获蛋白的工作缓冲液；

Ø 用来固着捕获蛋白的NC膜；

Ø 捕获蛋白自身；

Ø 将捕获蛋白点样于NC膜的系统；

Ø 捕获蛋白点样时的环境湿度。

虽然很多研发实验室对于免疫层析检测中使用的工作缓冲液和膜的特性进行了充分的研究，但他们不可能全面的研究或优化他们使用的系统和捕获试剂。这些忽略的步骤通常由于在开发之前就已经考虑恰当，因此在开发中很少有机会进一步调整。由于疏漏了对那些因素优化，研发人员常常集中精力优化他们认为必须优化的方面。

捕获剂 随着检测项目的不同，作为捕获剂的蛋白质各不相同。即便捕获剂差异的稍微，也没有一个捕获剂与另外的捕获剂完全相同。不同的蛋白捕获剂对不同膜的吸附能力不同，或许这一因素至关重要。单克隆抗体作为较均一的蛋白捕获剂，优化与NC膜的结合过程较为简单，而多克隆抗体由于含有针对大量不同的抗原决定簇的抗体，不同抗体的最佳结合条件可能稍微不同，从而导致蛋白与膜结合条件的优化过程较为复杂。比如IgA、IgM存在结构或者空间位阻等因素，其与膜结合条件的优化过程较为困难。比如BSA、A蛋白以及G蛋白由于化学性质或者分子太大较易吸附于固相载体，从而非常难将其吸附于NC膜。

仪器设备 捕获剂喷涂系统仍然存在某些问题，大多数商品化可用的（捕获剂喷膜、划线）仪器设备各有利弊。其可变参数包括能否喷涂给定的体积，能否触及条、垫或膜，喷涂速度以及喷涂后处理过程。体外诊断试剂生产商需要的最佳解决方案即为找到能够最有效地解决实际生产过程中面临的问题，比如原材料问题、生产能力问题。优化其他因素也可以优化特定的捕获线喷涂设备。

环境湿度 点膜时的环境湿度严重影响捕获线的质量，尤其对喷膜系统影响严重。如果空气湿度太低，则NC膜上聚集静电荷，从而导致蛋白质喷涂于NC膜表面时容易产生斑点，NC膜表面容易产生疏水斑。如果空气湿度太高，导致NC膜对捕获蛋白的毛细作用加强，从而容易引起捕获线变宽或者扩散。通常情况下，最佳的点膜环境相对湿度应保持在45-65%。为了确保原材料的均一性，点膜前应根据相应试验确定的最佳平衡时间将NC膜在工作环境中平衡。

工作缓冲液的优化 由于蛋白质捕获剂千差万别，不同蛋白的最大结合量工作缓冲体系各不相同。影响点膜工作缓冲液的重要因素有两个。

Ø 蛋白质的可溶性（即用于吸附于NC膜的蛋白量）；

Ø 蛋白质分子的稳定性（即倾向于聚集或溶于水）

为了确保足够的蛋白喷涂捕获线，首先必须将捕获蛋白溶解于点膜缓冲液，而点膜缓冲液维持一定的离子浓度可以确保蛋白的可溶性。尽管点膜工作液具备一定的离子强度有助于控制捕获剂的PH值，但也可以干扰蛋白质结合的静电相互作用。因此，确定维持足量的捕获蛋白浓度的最低可能离子强度至关重要。

如果特定浓度的蛋白质分子在溶液中稳定，那么就会溶解于溶液中。但是如果它的能量状态有利于形成固体，那么吸附到NC膜上的蛋白量多于稳定溶解在溶液里的蛋白量。采用破坏稳定剂或者沉淀剂能够诱导产生这种能量状态，但是如果诱导过度也可能引起其它的问题。如果蛋白在点膜以前沉淀，那么整个试剂系统就高度不稳定且几乎完全不可重复性，导致剩余的吸附到NC膜上的溶解蛋白量剧烈减少，而且沉淀物也可造成诸如堵塞喷涂设备管道或者NC膜微孔等问题。在某种情况下，点膜过程中为了达到适量的蛋白吸附必须将蛋白质处于不稳定状态，有些情况也有例外。

上述分析表明，通过调整蛋白喷涂工作缓冲系统的属性能够改变蛋白质与NC膜的结合作用，其中核心属性涉及缓冲液的离子强度、酸度及所用沉淀剂浓度。

离子强度 在给定的离子强度范围内，蛋白质溶解度随着工作缓冲液中盐浓度的增加按比例增加。为了降低溶液中捕获蛋白分子的稳定性，溶液的离子强度应该尽可能低，这样可以增加蛋白质与NC膜结合的速度。同时，研发人员也应该注意，高浓度盐能够引起蛋白沉淀，而且喷膜后的干燥过程中大量的盐能够干扰检测试剂的稳定性和灵敏度。

酸度 点膜工作液的PH值相当显著的影响蛋白质与NC膜的结合效果。通常蛋白质在等电点时的溶解度最低的。因此，研发人员为了降低溶液中捕获蛋白分子的稳定性，将捕获蛋白的等电点作为理想的喷膜工作缓冲液的Ph值。

共沉淀剂 研发人员通常选择添加不稳定剂或共沉淀剂降低溶液中蛋白质的稳定性来调整喷膜工作缓冲液。IgG的Fc区和F（ab）区对共沉淀剂的稳定性不同，而且Fc区结构更可能被共沉淀剂降解，部分不稳定的Fc区导致更多在正常情况下隐藏在蛋白质内部的疏水基团暴露。因此，不管那种蛋白质与NC膜的结合机理被接受，由于采用共沉淀剂增加的蛋白质疏水性将提高蛋白质与NC膜的结合能力。

图6 采用不同缓冲液以1mg/ml 鼠IgG划线的检测结果

最常用的共沉淀剂时醇类，醇类有许多理由值得推荐。醇类的存在有助于NC膜的重湿润，减少NC膜可能带有的静电，而可以降低溶液中的蛋白质稳定性。在基于膜的免疫分析中，3-5%的甲醇可以极大地提高检测性能。

在几年前，将醇类提高蛋白质与固相载体的结合性能应用于ELISA微孔板生产中，而现在这方法已经作为标准的操作规程。脂肪醇对NC膜结合蛋白的影响发表于1980年，加1%异丙醇作为固定剂在western blotting 实验广泛应用。

虽然其他物质如硫酸铵等作为沉淀剂有时也有很好的效果，但是它们通常不如醇类，这类型的试剂浓度稍微的变化都会严重影响蛋白质的沉淀效果。鉴于这种原因，通常不会使用醇类以外的其他共沉淀剂。

综上所述，新产品开发的喷膜工作缓冲液为：10mM PH7磷酸缓冲液+3%甲醇。虽然这种缓冲液不是所有蛋白质的最佳工作液，但它为开发过程提供了一个极好的起始点。

膜对蛋白质结合的影响

在快速诊断检测中，NC膜在三个方面显著影响蛋白质的结合。

Ø NC膜的孔径

Ø 膜的后处理

Ø 膜的类型

由于作为捕获剂的蛋白质种类繁多，没有一种NC膜作为最佳NC膜适合于任何快速检测反应。不同类型的NC膜与蛋白质的结合能力差别较大（见图5），这就意味着任何一个新产品的开发都必须重新筛选膜。另外，对膜等额外优化可能会进一步提高快速检测试剂的性能与重复性。

孔径 研发人员在侧向免疫层析中应谨慎的对待NC膜供应商提供的NC膜标称孔径。膜的实际孔径取决于采用的测量方法，而不同膜生产商采用不同的测量方法，因而两个相同标称孔径的NC膜采用相同的测量方法检测其实际孔径差异显著（图7）。

图7 采用Coulter气孔计检测的NC膜孔径数据

通常在竖向过滤即根据NC膜的厚度检测NC膜的孔径，而竖向过滤测定的膜孔径和类型与侧向过滤测定的膜孔径与类型没有相关性。因此，在侧向免疫层析中，常规方法测定的NC膜孔径与实际孔径有一定的差异。如果NC膜带有塑料底衬，则无法用竖向过滤测定膜的孔径。在这种情况下，供应商提供的膜孔径常常为基于侧向毛细作用进行估计。

研发人员也可以慎重地根据标称孔径区分同一厂家的NC膜，但不推荐采用这种方法区分不同厂家生产的NC膜。尤其对于侧向层析来说，标称孔径不是NC膜蛋白质结合能力的依据，建议研发人员进行新的研发项目前最好筛选最佳的NC膜。

尽管标称孔径实际意义较小，但NC膜的侧向孔径和膜的结构对于NC膜是否能应用于侧向层析有重要的影响。在一定的范围内，NC膜的有效表面积随着标称孔径的减小而增加，从而NC膜的蛋白结合能力随之增加。不同孔径NC膜的近似表面积可以通过各种材料的比表面积率（SAR）进行估计。比表面积率即NC

表I Whatman NC膜比表面积率检测值（BET表面积检测方法检测数值）

膜孔内的有效表面积与膜表面积的比率（表1）。另外一个重要的因素即为随着NC膜孔径减小，侧向层析的毛细作用也降低（表2），从而由于待检分析物与捕获蛋白较长的反应时间增加了侧向免疫层析的检测灵敏度。

图8 后期处理过程中存在水，可能导致捕获线存在条纹或产生严重的批间差异。

上述两种现象的综合效应即为采用较小孔径的NC膜可以显著提高检测的灵敏度。作为常规的指导方针，如果研发人员比较关心最终检测的灵敏度，则应该选择尽可能小孔径的NC膜；如果研发人员比较关心侧向层析的反应速度，则应该选择较大孔径的NC膜。在产品研发早期阶段，无论需要什么种类的NC膜，研发人员最好应该尽可能筛选最佳的NC膜。

后处理 NC膜生产后通常进行膜的后处理，可以去掉膜表面的没有聚合的单体分子或者改善NC膜的重湿润性。另外，后处理可以为NC膜添加少量的化学试剂或其他物质以进一步提高最终检测试剂的性能。通常情况下，生产厂家应该知道在NC膜上添加什么物质，并掌握添加浓度和程序。在NC膜添加剂存以及NC膜结合一定蛋白质的条件下，NC膜添加剂对膜爬行速率、老化情况的具有明显的影响效果。

在生产过程中，大量的企业为了保持NC膜的亲水性而对其进行后处理。实际上，就捕获线点膜于NC膜等生产流程以后或到达终端用户以前是否对NC膜进行亲水性处理意见不同。由于减少了侧向免疫层析检测试剂生产商必须的膜处理程序，购买的经过预处理的NC膜拥有迷人的魅力。这种处理过的NC膜可以直接现货供应，从而免除了购置蛋白质喷膜后进行处理NC膜仪器设备的费用，并缩短的生产周期。在购买处理过的NC膜以前，研发人员应该考虑下列可能不适应生产的情况。

NC膜的储存超过使用效期，导致在捕获蛋白喷膜以前NC膜的亲水性添加剂从膜上脱落，这是使用处理后NC膜的主要缺憾。NC膜上亲水性添加剂的浓度改变也会影响NC膜的蛋白结合能力、膜的亲水性以及侧向爬行速度。因此，检测试剂的有效期取决于膜亲水性添加剂的含量、从NC膜生产到检测试剂生产的时间间隔以及检测试剂进行测试时面临的未知因素。另外，如果生产商购买后对NC膜进行后处理，研发人员应记录NC膜上亲水性试剂浓度并对其进行充分的稳定性研究，从而建立最佳的后处理程序确保膜的使用和长时间储存。

未处理的NC膜的亲水性与其孔径直接相关，但亲水性试剂处理的NC膜亲水性则由其处理试剂决定。如果NC膜在储存时处理试剂脱落或测试时被样本冲走，那么膜的实际性能与其标称性能相比发生剧烈的变化。通过原始质控检验，生产商可以确定亲水性处理和孔径结构对NC膜的综合影响。如果亲水性处理试剂老化或从NC膜上脱落，从而使NC膜的性能取决于膜孔径的比例增加，导致原始质控检验无效。研发人员通过采用孔径结构一致的不同批号且未经亲水试剂处理，以尽量确保产品的最小变异系数。

表II Whatman膜的典型层析率数据

由于许多处理试剂都是水溶性的，喷涂捕获线时，任何水的存在均可冲掉捕获线处的处理试剂，导致膜上部分区域由于没有亲水性处理剂而高度疏水，使捕获蛋白不能与待测样本、胶体金结合物充分结合，严重影响试剂盒的敏感性和特异性。疏水斑点常常引起样品不均一通过捕获线，使检测结果产生条纹或显色深浅不一致（图8），甚至检测结果呈现白色条纹。如果在喷涂捕获线后进行亲水处理，则可避免这些缺陷。

研发人员应该根据时间、成本权衡处理过或者没有采用表面活性剂处理的原料在确保试剂稳定性与精密性上的优势。
膜的类型  不管膜的孔径或者何种添加剂对其处理，NC膜的类型显著影响着其蛋白结合的水平。图5显示不同制造商生产的不同标称孔径NC膜对免疫球蛋白和白蛋白的不同结合水平比较。一系列的数据显示了结合水平上的差异与NC膜标称孔径变化关系不大。通过对图表比较表明，免疫蛋白结合最佳的膜对白蛋白结合不一定最佳。因此，相关蛋白结合水平不仅受NC膜设计形式的影响，还受到生产商原料来源的影响。

对于有固定表面积的一系列NC膜来说，蛋白质的结合水平是由NC膜的聚合物类型与影响膜表面能量的处理试剂共同作用的结果。生产NC膜的基本聚合物可以适用于许多商业途径，而且不同使用途径性能上都有稍微差别，况且不同NC膜生产商采用不同的处理方法。因此，建议研发人员通过试验评价使用的NC膜及其对相关蛋白结合能力。

NC膜的老化 如果NC膜未经过亲水性添加剂处理，新生产的NC膜将在其表面残留约5-10%的湿气。涉及NC膜老化的传统观念一致认为残留的湿气可以挥发掉，因此，随着NC膜湿气的挥发，NC膜渐渐变得疏水、聚集静电荷和易脆。实际上，并非如此简单。有些关于NC膜老化的研究认为，NC膜残留的湿气是可挥发的，而最近研究表明，NC膜在长期高相对湿度的储存条件下，仍然保持疏水效果。

经过亲水性试剂处理的NC膜稳定性取决于亲水性添加剂的性质。储存NC膜时，避免接触容易引起NC膜产生疏水作用的有机溶剂和膜聚合物断链的强光照射非常重要。目前，在正确的储存条件下（45-55％相对湿度），NC膜至少稳定储存2年以上。喷涂捕获线以后封闭的NC膜可以储存更长时间。

NC膜爬行速度的优化 NC膜的爬行速度是影响免疫分析结果的关键因素之一。在NC膜、检测线以及待测样本浓度确定的情况下，检测的灵敏度随着爬行速度的下降而提高，即随着NC膜爬行速度的下降，显示的待测样本浓度提高。表III 有效的膜封闭材料

两者遵循一个与平方成反比的规律，即：

显示的待测样本浓度α1∕(层析速度)2

因此，若NC膜爬行速度提高一倍则待检样本浓度显示为原来浓度的1/4.

封闭剂 NC膜本身为疏水材料，而NC膜对水的层析作用主要由于其纤维间隙存在水份。NC膜的疏水作用主要由以下三个因素造成：

Ø 疏水待测物与NC膜非特异性反应而产生的非特异性信号；

Ø 纤维间隙水份丧失引起的长期储存困难；

Ø 快速检测中的重润湿速度、爬行速度太慢

对喷涂捕获线后的NC膜封闭处理可以减少或消除这些现象。在理论上，研发人员应选择有助于确保产品的稳定性和可重复性的封闭剂。选择的封闭剂应同时降低非特异性背景，在长期保存条件下仍能结合在膜上，而且在样品检测时能保持NC膜均一致的重湿润特性。同时，封闭剂也不应干扰捕获线处的抗原抗体反应而降低检测的信号强度。

图9 不同结合物、表面活性剂的封闭效果

鉴于理想封闭系统的关键特征，封闭剂的选择常常需要研发人员在以下四个方面寻找最佳的平衡点：

Ø 爬行速率

Ø 捕获线的强度

Ø 捕获线的宽度

Ø 非特异性背景的强度

不幸地，上述几个关键指标常常互相矛盾。比如，封闭剂减少非特异相互作用同时也会降低特异性信号，而增加膜爬速的同时也会降低检测的灵敏度、增加检测线的宽度。笼统地说，这几种封闭剂主要分为三类：

Ø 表面活性剂；

Ø 人造聚合物；

Ø 蛋白质；

通常情况下，表面活性剂与人造聚合物至少两类封闭剂混合使用可起到较好的封闭效果（见表3）。而蛋白质通常不是最有效的封闭材料，虽然蛋白质类封闭剂有助于减少非特异性信号，但是他们也会降低整个检测系统的爬行速度（图9，10）。

图10 不同封闭剂的封闭效果。

封闭方法 如果NC供应商已经用亲水性试剂处理过NC膜，那么检测试剂生产商则不必重复这一过程。如果必须封闭，通常进行如下三个步骤执行。

（1）将膜浸泡于饱和的预定浓度的封闭剂溶液中；

（2）将含高浓度的试纸条下端部分（胶金垫或样品垫）干燥；

（3）检测待检样本时，干燥的封闭剂重润湿并随样本溶液层析。

无论采用那种封闭系统，研发人员都必须对检测试剂进行充分的稳定性评估。虽然加速老化试验可以用来评价检测试剂的近似有效期，在解释试验结果时必须仔细解释原因。在加速老化试验中，典型的换算参数为37℃条件下的有效期乘以10.因此，在37℃下可保存4周的试纸条，在室温下则可保存40周。尽管行业内普遍以该参数作为可靠的转换方法，但并不能保证该换算的稳定性。

结论

该部分主要报道了影响蛋白与NC膜结合的主要因素。本文的第二部分将发表于IVD technology，将提供如何解决在侧向免疫层析研发、生产中蛋白与NC膜结合面临的问题。

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作者简介：Kevin D. Jones博士， Whatman国际有限公司(Maidstone, Kent, UK)诊断技术经理。

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