人类基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析

实验目的：

1. 熟悉分子生物学实验的操作特点。

2．掌握人类基因组DNA提取的基本原理。

3．熟悉人类基因组DNA提取的基本方法。

4．熟悉琼脂糖凝胶电泳的原理和操作。

实验原理：

用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，经苯酚-氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后，溶解于TE中即得到高分子量的DNA。

本次实验使用的试剂盒系直接加入裂解液裂解细胞后，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，并使用RNaseA降解RNA，再利用特殊硅基质膜吸附DNA的特性，可快速、高效地纯化回收基因组DNA。

操作步骤：

1. 细胞裂解与RNase/蛋白酶K 消化

① 取100 μl抗凝全血置于1.5ml Eppendorf离心管中，再加入100 μl裂解液和20 μl RNaseA/蛋白酶K液，用移液器来回吹打混匀，室于55℃温浴35分钟，其间来回颠倒离心管几次，直至溶液呈水溶状。

② 加入10μl 3M的NaAc(pH 4.8)，随后加入1250 μl结合缓冲液，充分振荡混匀，12,000 rpm离心30秒。

2. DNA与吸附柱结合

用移液器Tip转移上清并加入到离心吸附柱（套好收集管）中，放置1分钟，12,000 rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。注意：待转移上清约1300μl，离心吸附柱容量约650 μl，故需每次转移上清650 μl到离心吸附柱中，离心，倒掉收集管中的废液，重复实验操作步骤3。

3. DNA的纯化

① 再加入600 μl洗涤缓冲液（washing buffer）到离心吸附柱（套好收集管）中，12,000 rpm 离心30秒。

② 重复步骤4一次，12,000 rpm 离心3分钟以充分除去洗涤缓冲液。

③ 小心取出离心吸附柱，弃收集管，将离心吸附柱套入一个干净的1.5ml Eppendorf 离心管，并加入50 μl洗脱缓冲液(elution buffer) 到离心吸附柱中(洗脱缓冲液一定要加在离心吸附柱的正中)，放置1分钟，于12,000 rpm 离心30秒。

④ 取出Eppendorf 离心管，其中便是所提取基因组DNA。

4. DNA的琼脂糖凝胶电泳

取8 -10μl基因组DNA，并加入2 μl上样缓冲液，混匀，加样到1%琼脂糖凝胶点样孔中，电泳。