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        生物技术常用实验操作简单介绍

        互联网

        11190

        一、总RNA的提取(Trizol法提取)

        在收集到生物材料之后,最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存,则应以液氮将生物材料急速冷冻后,储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时,将储存于冷冻柜的材料取出,立即以加入液氮研磨的方式打破细胞,不可以先行解冻,以避免RNase的作用。

        1. 提取组织RNA时,每50~100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解;提取细胞RNA时,先离心沉淀细胞,每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后,反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞;

        2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟;

        3. 在上述EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿,盖上EP管盖子,在手中用力震荡15秒,在室温下(15℃~30℃)放置2~3分钟后,12000g(2℃~8℃)离心15分钟;

        4. 取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇,在室温下(15℃~30℃)放置10分钟,12000g(2℃~8℃)离心10分钟;

        5. 弃上清,按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤,涡旋混合,7500g(2℃~8℃)离心5分钟,弃上清;

        6. 让沉淀的RNA在室温下自然干燥;

        7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

        二、琼脂糖核酸电泳

        1. 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净,放在制胶平板上,封闭模具边缘,架好梳子;

        2. 根据欲分离DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶:准确称量琼脂糖干粉,加入到配胶用的三角烧瓶内,定量加入电泳缓冲液(一般20~30 ml);

        3. 放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻,加入一滴荧光染料,轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液,倒入电泳槽中,待其凝固;

        4. 室温下30~45分钟后凝胶完全凝结,小心拔出梳子,将凝胶安放在电泳槽内;

        5. 向电泳槽中倒入电泳缓冲液,其量以没过胶面1mm为宜,如样品孔内有气泡,应设法除去;

        6. 在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液(loading buffer),混匀后,用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内;

        7. 接通电源,红色为正极,黑色为负极,切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60~100V电压,电泳20~40min即可;

        8. 根据指示剂泳动的位置,判断是否终止电泳;

        9. 电泳完毕,关上电源,在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置,并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。

        琼脂糖凝胶浓度 线形DNA的最佳分辨范围(bp)

        0.5% 1,000~30,000

        0.7% 800~12,000

        1.0% 500~10,000

        1.2% 400~7,000

        1.5% 200~3,000

        2.0% 50~2,000

        三、胶回收纯化DNA

        1. 琼脂糖电泳,将特异电泳带用刀切下放入到EP管中,称琼脂糖带的重量;

        2. 按照每100mg加400μl的量加入binding buffer,放入到EP管振荡器中,45℃~55℃温育振荡,直到所有的琼脂糖都溶解(大概要5分钟);

        3. 取出纯化柱,将上述溶解液转移至柱中,室温下放置2分钟,8,000rpm 离心1分钟,弃EP管中的液体,将纯化柱放回EP管中;

        4. 加500μl的wash buffer至柱中,8,000rpm 离心1分钟。弃管中的溶液;

        5. 重复操作4步的操作1次,最后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30秒,除去痕量的wash buffer;

        6. 将纯化柱放入一个新的EP管。加30~40μl H2O或者elution buffer至纯化柱膜的中央,在37℃或50℃下放置2分钟,10,000rpm离心1分钟洗脱DNA,将EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。

        7. 注:若想要不电泳而直接纯化DNA溶液,只需要在第2步中按100μl液量加400μl的binding buffer,其余的步骤不变。


        四、大肠杆菌质粒DNA的提取(碱裂解法)

        此方法适用于小量质粒DNA的提取提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增。

        1.  取1.5ml细菌培养物于EP管中,4000rpm离心1分钟,弃上清液,使细菌沉淀尽量干燥;

        2.  将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100 μl溶液I (50 mmol/L葡萄糖,10 mmol/L EDTA pH 8.0,25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中,剧烈振荡;

        3.  加入200 μl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH,1%SDS(m/v)),盖紧EP管口,快速颠倒离心管5次,以混合混合物,确保离心管的整个内表面与溶液II接触,不要涡旋,置于冰浴中;

        4.  加入150 μl预冷溶液III(每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸钾,11.5 ml冰乙酸,28.5 ml H2O),盖紧EP管口,反复颠倒数次,使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,之后将管置于冰上3~5分钟;

        5.  在最大转速下离心5min,取上清液于另一新EP管;

        6.  用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA,振荡混合于室温放置2分钟,最大转速离心5分钟;

        7.  小心吸去上清液,将离心管倒置于滤纸上,以使所有液体都流出,在将附于管壁的液滴除尽;

        8.  加1ml 70%乙醇洗涤沉淀,振荡混合,用12,000g离心2分钟,弃上清,将开口的EP管置于室温使乙醇挥发,直至EP管中内没有可见的液体存在(5~10分钟),用适量的ddH2O溶解;

        9.  用0.5μl的RNase 37℃温育5~10分钟;

        10.  电泳鉴定。

        五、感受态细胞的制备

        1.  挑取适当菌株的E.coli 单菌落接种于2ml SOB培养液中,37℃摇床过夜。

        2.  取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50ml SOB中,18℃剧烈震荡,直到A600达到0.6。

        3.  将培养物转移到50ml离心管中,4℃ 4,000rpm/min离心10min。同时在冰浴上配置TB溶液。

        4.  弃上清,将离心管倒置于滤纸上,使培养液被吸干。

        5.  取1ml刚配的TB溶液打散菌体沉淀,再加入15ml TB(1/3体积的起始培养液),冰浴10-15min,4℃ 4,000rpm/min离心10min。

        6.  弃上清,沉淀重悬于4ml TB(1/12.5体积的起始培养液),冰浴10min。

        7.  加入280μl DMSO,缓缓滴入并轻轻摇晃,使其充分混合均匀,冰浴10min。

        8.  将菌液分装于EP管中,-80℃或液氮冻存。

        9.  取两管感受态细胞分别加入1μl无菌ddH2O(阴性对照)和1μl纯质粒(阳性对照)进行转化(见后),以检测感受态的质量。阴性对照平板上应该无菌落生长,阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。

        六、SOB的配制:

        蛋白胨 20g

        酵母提取物 5g

        NaCl 0.58g

        KCl 0.186g

        100×Mg++溶液 10ml

        溶解并加水定容至1L,121℃×20min高压蒸汽灭菌

        100×Mg++溶液:

        MgCl2﹒6H2O

        MgSO4﹒7H2O

        溶解并加水定容至100ml,121℃×20min高压蒸汽灭菌

        TB溶液的配制:

        1M KCl 5ml

        0.55M MnCl2 2ml

        0.5M CaCl2 0.6ml

        0.1M K-Pipes(pH 6.7) 2ml

        ddH2O 10.4ml

        Total 20ml

        注:上述溶液均需高压蒸汽灭菌处理

        0.1M K-Pipes(pH=6.7)的配制:

        称取3.02g Pipes粉末溶于80ml dd H2O中,此时粉末不能完全溶解,用10N KOH或KOH固体调节PH值,只有当PH接近6.7时粉末才能完全溶解,此时当小心少量地加入KOH直至达到所需PH值。

        七、转 化

        1.  取100μl感受态细胞于冰浴上融化。

        2.  加入1μl纯质粒或连接产物,轻轻吹打混匀,冰浴30 min。

        3.  将菌液放入42℃水浴中热激90秒,立即放入冰浴中2 min。

        4.  加入0.9ml SOC,于37℃恒温摇床上200rpm×1hr温育。

        5.  将菌液4000rpm/min离心3min,留200μl上清将菌体打散,均匀涂布于含适当抗生素的琼脂平板表面,平板于37℃倒置培养过夜。

        i.  注:新倒的平板可于37℃培养箱中预先放置数小时至过夜干燥。

        ii.  当转化的是TA克隆连接产物时可在菌液中加入8μl 1M IPTG和40μl 20mg/ml X-gal以进行蓝白斑筛选。

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