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        如何使PC12细胞贴壁更牢

        互联网

        9861

        丁香园ivy_mayan的问题:

        在做PC12的H2O2损伤模型时,由于细胞经过H2O2的冲击,大多活性不好了,所以贴壁性变差,结果在测MTT时由于要去掉上清液,细胞会被一同吸走,这样所测吸光值就不准了,请问大家,怎么可以使PC12贴壁更牢(即使经过损伤冲击)?

        丁香园george的观点:

        1.细胞培养板的选择:一定要用进口的培养板,国产的大多贴不好。

        2.尽量使细胞处于良好的状态,包括培养液要新鲜配制备,注意PH值,提高牛血清的浓度。

        丁香园midas的观点:

        1.用PLL或鼠尾胶包被扳子!

        2.H2O2浓度越大,作用的时间应该越短。

        3.MTT时,不必要完全吸去上清液(当然每个孔吸出的量应该一样多),尽量不要洗掉细胞。

        丁香园drcici的观点:

        细胞的贴附状态涉及很多方面,细胞的类型,细胞本身的状态,培养条件以及培养板等因素都可以影响细胞的贴附。

        除了以上高手的经验外,我想还要注意PC12的密度,一般良好状态的PC12生长迅速,可以在2~3天就可以长满一个中皿,如果你用96孔板的话,长满的时间应该更短。但是长得过满的细胞状态并不好,容易脱落,不知你的PC12是以何种密度接种的,什么时间加双氧水?最好是在PC12长至70-80%时加双氧水。

        还有加入的双氧水的温度,也要与培养温度相同,去除双氧水后,要用培养液把细胞洗2-3遍。

        丁香园ivy_mayan的问题:

        具体我是这样操作的:96孔板

        以2x10的五次方密度接种细胞,24小时后加入不同浓度的h2o2(50-500UM), 作用不同时间后(0-8h)加入MTT,孵育4h后去上清,加入DMSO溶解结晶,测490nm下的吸光值。

        我有以下疑问:

        1)板我已经过poly-l-lys处理过,但是细胞贴壁还是不好,如何解决?

        2)加入MTT前是否要把培养液去掉, 并用PBS洗两遍以彻底去除H2O2及血清的影响,只是这样一来细胞会丢失很多,该如何解决?


        丁香园midas的观点:

        1.增加PLL的浓度,50-100ug/mg

        2.没有必要把培养液去掉,并用PBS洗!H2O2及血清对MTT的影响好像 还没有见到相关报道。

        丁香园liandchu的问题:

        我培养的细胞是pc12细胞,这种细胞不好贴壁,我用多聚赖氨酸包被,但我不知道多大分子量多聚赖氨酸及浓度去包被效果好?,

        丁香园luopeng的观点:

        用赖氨酸包被培养板和培养瓶时,应该选用多聚左旋赖氨酸(分子量为15-30万) ,我们用的是sigma P7890,效果还不错。

        丁香园sweet的问题:

        我打算养pc-12 ,听说这个细胞很难伺候,请教培养方法。何种培养基好?NGF的种类有讲究吗?

        丁香园lrmoon的观点:

        PC12细胞我养过,谈一谈体会,希望对您有帮助。

        总体上PC12细胞不难养,不要有畏惧思想。

        1.Medium:DMEM加2.5%FBS, 15%horse serum(都用Gibco的)

        2.复苏后首次分皿时经消化后尽量用tip头柔和吹打15次,使成单细胞。

        3.诱导可在经poly-l-lysine coating的24孔板中进行,细胞的种植密度不可太高,1×10E5即可。一般情况下经NGF50ng/ml一周就可见很明显的诱导特征(突起伸长,胞体变小,增殖减缓)

        4.包被非常重要。PLL要质量好,不要多次回收使用,一般使用两次就丢弃。包被过夜后要彻底用灭菌ddH2O洗3遍。

        5.实验尽量使用同一批号的试剂,以免细胞的表型发生变化影响实验结果。

        6.NGF的质量也很关键,建议用sigma的。

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