1、侵袭实验与转染细胞问题。
问：我要做侵袭实验，但我做的是瞬时转染的贴壁细胞，我想请教各位，瞬时转染后多长时间，可以消化细胞进行transwell小室的细胞接种？
答：最好是24小时，我们科有两个都用二十四小时，但也有文献报道说用48小时。如果是稳定转染，则需要在对数生长期接种细胞。
2、原代成骨细胞培养不贴壁问题。
问：我用新配置的0.25%胰蛋白酶消化骨片30分，然后用胶原酶消化90分，培养24小时后，发现一半贴于壁上，但没有形态变化，另一大半浮于培养液中，36小时一小部分发生形态变化，为什么会发生这种情况？
答：很可能是培养基里血清浓度偏低，细胞就不易于贴壁。
3、大鼠原代肝细胞不贴壁问题。
问：用出生小于三天的大鼠做原代肝细胞，用酶消化法分离细胞，在用1640+FBS来培养。做了几次，可细胞就是不贴壁。是什么原因？
答：可能原因有如下几条：
(1)我们用胰蛋白酶消化，发现贴壁比较困难，因为影响胰蛋白酶消化能力的因素太多，比如浓度、PH、温度、时间等，很难把握好最佳的条件，建议用胶原酶消化，使用浓度为0.2%，过夜消化(10小时左右)。然后过滤接种。
(2)细胞接种密度的问题：我们第一次接种时密度太大，结果三天仍没有贴壁，后来我们用三个六孔板摸索细胞接种浓度，结论是只要不超过10的6次方每ml，一般问题不大。
(3)血清浓度对细胞贴壁也有一定的影响，我们的经验是先用20%的血清(进口可用15%)促进贴壁，待贴壁2天后换用一般生长浓度。
(4)如有条件可加入少量肝细胞生长因子，若没有条件，可搜集其他养肝癌细胞同学细胞培养液的上清液，筛网过滤后(300目)接种也行。
(5)如若楼主使用的的是玻璃培养瓶，建议使用促进细胞贴壁得物质，如多聚赖氨酸，明胶，或用小牛血清(5滴)包被培养瓶过夜。
(6)看看自己得培养箱有没足够的水，保持足够的湿度。
建议用塑料小培养瓶，一次性的那种，细胞更容易贴壁。
4、SOD测定方法的问题。
问：我要测细胞胞浆中SOD活性的变化，用722分光光度计测定，想请教如何处理细胞？是用细胞裂解液还是用超声细胞粉碎器粉碎细胞？还是先裂解液裂解后在超声粉碎？我用细胞裂解液做过，实验趋势出来了，但数值较小，是怎么回事呢？
答：我测过细胞胞浆中的ALP活性，用的是超声细胞粉碎机破碎的细胞，数值还可以。你的数值较小，是否细胞密度小？你测的是比活性吗？有没有测蛋白浓度？
5、问：培养乳鼠心肌细胞需要200目尼龙滤网，怎么消毒？
答：用布包起来高压灭菌，我们用的是不锈钢筛网，放到盒子里跟手术器材一起高压灭菌。也很便宜。
6、抗氧化剂的选择问题。
问：我做细胞共培养实验，想选择一种抗氧化剂来阻断上清中大量的ROS，应该选择那种比较好呢？过氧化氢酶或是超氧化物歧化酶可以吗？
答：我做的是细胞的，用NAC，不过不知道你的上清可以用不。
7、问：成骨细胞功能检测的方法，除了ALP活性和钙结节染色计数还有哪些？
问：我实验最后一步准备检测矿化结节形成量，用钙结节染色计数法，但觉得实施起来难度很大，一是药物很多，检测浓度也很多；二是培养时间长，要18天，3天就要换液一次，工作量太大；三是结果靠目测，不太可靠。请问还有其他检测成骨细胞功能的方法吗？且周期短，实验仪器要求不高。
答：要不你就测细胞内钙离子浓度？测定细胞内钙离子浓度是成骨细胞一个指标啊！该指标可以反映成骨细胞摄取钙的能力。不过一般用得很少，我只见过一篇文章用过。我正在做矿化结节，我有三个药，每个药5个浓度。觉得还行，后面就是换液。
8、原代RPE细胞生长缓慢问题。
问：我养的猪RPE细胞，生长非常缓慢，都快一个月了还没有融合，不能传代，接连养了好几批都是这种情况，有一瓶长到3/4的时候试着传了一次，结果还是长的很慢，6月4号传的，现在长了还不到一半，我用的国产20%新生小牛血清DMEM，这两天试着加了些谷氨酰胺，效果不明显，细胞没有发现污染，是不是血清品质的问题，看别人的文献都说原代4-5天就可以传代了。
答：细胞生长缓慢可能有几个原因：
(1)细胞污染：有些污染不是细菌，也不是支原体等，在四十倍才能看清楚，是像细胞质内的杂质一样大小的黑点，会动，由于小，不易发现。
(2) 培养液pH值问题，一定测测它值，最好用pH计测，这样准些，定在7.2，因为时间长了会变碱，所以最好调到7.15-7.20，宁酸勿碱。
(3)培养基的问题，国产确实不如进口的好，也可能是小牛血清浓度低。
(4)培养瓶使用时间过长。
建议：
(1)调pH值。
(2)确定细胞没污染，用新的培养瓶培养。
(3)用更高浓度的血清激一下，比如25%的血清浓度，然后细胞融合生长起来后(融合后生长会加速)，再慢慢换回原来浓度。
9、用低血清的培养液培养细胞的问题。
问： 如果用低血清的培养液培养细胞12h可以达到同步化吗？细胞种到板上12h后可以把培养液化成低血清的进行同步化吗？
答：细胞同步化是指为研究细胞周期的不同阶段的生化特征，必须获得细胞周期一致性的细胞。因此，你首先看看是否需要用同步化的细胞！
如果你做的实验中干预因素是促进细胞生长的，我认为是需要做无血清或0.5%浓度血清(有些细胞无血清生长不好)同步化的；如果你做的实验中干预因素是抑制细胞生长的，那细胞无血清同步化就可以不是太严格要求。
但是尽可能使每组实验细胞处于G0期，或者在同一生长周期，这对于实验结果的可信度和可重复性是十分有好处的。
同时，不同的细胞干预的时间是不同的，一般需要16-24小时左右。种到扳子上最好等24小时后再同步化，全部贴壁后，有个适应过程。要是悬浮细胞就不那么严格了。
10、MTT法做淋巴细胞转化试验的问题。
问：(1)采集淋巴细胞时，心脏血和静脉血有无区别？
(2)淋巴细胞培养多久后加MTT？偶做的是鸭淋巴细胞，资料上至少都是六十几个小时，如果MTT加早了有什么结果？
(3)偶培养24h后发现，淋巴细胞有成团的现象，是否正常？
(4)用酶标仪测OD值时，对照应该用什么，是用二甲亚枫、培养基加二甲亚枫、还是培养基加二甲亚枫加MTT？或加其它什么？
答：只要分离到了淋巴细胞心脏血和静脉血基本上都没问题，但是采集淋巴细胞时会有困难，还有，在分离时会有一点影响，具体的差异没有统计比较。淋巴细胞用多克隆刺激剂在44个小时或是68个小时加MTT都可以，用特异性的刺激物时间要长一些。
时间太短增值不够，检不出结果，时间太长，很多细胞会发生调亡，也会影响结果。你要摸索一下，找最大的结果。
淋巴细胞有成团，那是增值的小团块，没有问题。
在加样品时就要设培养基对照(只有培养基，没细胞)，阴性对照(只有细胞，不加刺激物)。后面的跟实验组一样处理。
11、人DC细胞培养和收获问题。
问：(1)当DC养到5-6天的时候是不成熟DC，它是贴壁生长的，如果我要用这种DC，如何把它制成悬液呢？制成悬液后它的功能形态会改变吗？(2)6天后加入刺激它成熟的因子后，它就是成熟DC并且悬浮起来了吗？或者如果DC贴壁的时候我可以用一些蛋白来评价它捕获抗原的能力吗？
答：(1)可以将人的单核细胞加入IL-4和GM－CSF向DC诱导，观察到随着培养时间的延长，细胞形态由圆形逐渐转变为多突起形，也逐渐浮起来，并不是完全贴壁生长的。吸起来制成悬液之后计数观察，形态没有变化。进行流式细胞术检测，CD14下调，CD1a、CD80、CD86、HLA-DR都上调，CD83变化不大。
(2)6天后加入TNF-a或者LPS，悬浮起来的细胞更多，进行流式细胞术检测，CD14下调，CD1a、CD80、CD86、HLA-DR都继续上调，CD83也大幅上调。
12、Transwell中的问题。
问：我现在也在做运动试验transwell，用的是去年7、8月份买的FN(分装后一直在低温冰箱里，前天才拿出来一支配成10微克/毫升的液体)，牛血清白蛋白也是那个时候配的，分装后冻起来。前天拿出来溶解，结果种入细胞(贴壁生长)后观察，发现细胞是均匀散开的，6小时后再看，发现它们聚成一团一团的，12小时及24小时看还是聚团的。试剂去年用的效果很好，这个细胞株的侵袭转移能力也是前人确定的，只是不明白为何现在做的时候连隐性对照的细胞也会聚团而不是转移？
答：我也遇到过这样现象，后来重复时发现，最大可能是加入孔里的牛血清白蛋白和FN没有凝，即使凝了也还有残留液体(我用的是matrigel胶，放37度过夜仍会有)，在加入细胞悬液前要吸出残留液体，再加无血清培养基水化基膜，然后再加细胞悬液。每一个细节都很重要。
