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        小鼠腹水抗体的制备

        互联网

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        1.抗原的处理与小鼠腹水粗抗体的收集


        现在以B亚基的抗体制备为例说明:


        取2mg的蛋白,溶于100µl的10%SDS中,加入等体积的上样缓冲液,沸水浴3min,进行SDS-PAGE。


        将胶的两边缘切带染色,脱色后在相应的位置从分离胶上切下未染色目的蛋白带,无菌水洗涤,用匀浆器匀浆后,再在2~5mM的PBS中透析5h以上,冷干。


        将冷干的样品用500~800µl 的2mM~5mM的PBS溶解(得到体积约600~1000µl),加入等体积的弗氏完全佐剂,大约乳化2h~3h。确保乳化完的蛋白浓度为0.5~1.0mg/ml。将乳化好的混合液用1ml的一次性注射器注射小鼠,每只50~100µl,即50~100µg的抗原蛋白。


        第一次加强注射:10~14天后将制备的样品用弗氏不完全佐剂乳化,同样注射小鼠。


        第一次加强注射后10天左右,用小鼠的血清,通过酶联免疫的方法(ELISA)测定腹水抗体效价来检测抗体的存在。


        第二次加强注射:如果ELISA得到阳性的结果,用弗氏不完全佐剂乳化抗原,再次注射小鼠,并在注射后的2~3天后注射H22腹水瘤细胞,每次注射量再1.5×106~2.0×106个细胞,7天后产生腹水。如果两周后小鼠仍无腹水,再次注射抗原以及瘤细胞。


        收集腹水,每只小鼠可以收集几次,每次3~10ml不等,收集腹水至小鼠死亡。腹水中加入0.01%的叠氮化钠以防止长菌,再在12000rpm离心2次,保留上清。测定效价后,进行抗体的纯化,分装,-70°C保存。


        [注]:

        (1)在SDS-PAGE时,分离胶中加入300µl SDS,浓缩胶中加入200µl SDS,以确保SDS足量。


        (2)在制备蛋白样品过程中会损失一部分抗原大约25%~50%


        (3)收集的小鼠腹水要分装到小指管中,不同的小鼠产生的腹水效价不同,做好标记。

        2.抗体纯化


        用1/10体积的1.0mol/L Tris(pH8.0)调节粗制抗体的pH值。


        用0.1mol/L Tris(pH8.0)平衡柱子。


        将抗体溶液用蛋白G微珠层析柱过滤,每次上2ml的样品。


        用10倍体积的0.1mol/L Tris(pH8.0)洗涤微珠。


        用10倍体积的0.01mol/L Tris(pH8.0)洗涤微珠。


        用2ml的50mmol/L 甘氨酸(pH3.0)洗脱滤柱。收集洗脱峰于装有1/10体积的1.0mol/L Tris(pH8.0)的试管内,轻轻摇匀。


        用10倍体积的0.1mol/L Tris(pH8.0)洗涤微珠。重复以上过程。


        测定蛋白浓度,并进行SDS-PAGE检测抗体的纯度。


        [注]:配Tris与甘氨酸溶液用盐酸来调pH值

        3.酶联免疫检测抗体的效价(ELISA)


        用包被液稀释抗原至50~100µg/ml,加入酶标板中,每孔100µl ,4°C过夜


        用洗涤液清洗酶标板3次,每次在摇床上摇5min~8min,37°C下用封闭液封闭酶标板4h以上。


        待测的腹水抗体按1:1000~1:128000稀释,分别加入孔中,每孔100µl,37°C孵育2h ,再用洗涤液清洗3次。


        将辣根过氧化物酶标记的二抗按照1:1000稀释,每孔加入每孔100µl,37°C孵育1h ,再洗涤3次。


        加入辣根过氧化物酶显色液100µl,显色5min后,加入终止液100µl,终止显色。


        以不注射抗原的小鼠腹水为阴性对照(也要相应于含抗体的腹水稀释),以只加显色液与终止液的孔为空白对照,用酶标仪测定492nm波长下的吸收值,确定抗体的效价。


        所用试剂:


        包被液:0 .50g Na2CO3,0.4g NaHCO3 ,200ml,pH9.6


        PBS :10mmol/LNaH2PO4, 10mmol/LNa2HPO4,150mmol/LNaCl,pH7.4


        封闭液:3%BSA溶于PBS中


        洗涤液:0.05~0.1%Tween-20溶于PBS中


        底物缓冲液:0.1mol/L柠檬酸,0.2mol/LNa2HPO4,pH5.0,用时每10ml的缓冲液加入4mgOPD(邻苯二胺)以及20µl 30%H2O2


        终止液:2mol/L H2SO4


        [注]:

        (1)在洗涤时应当确保充分,否则会出现阴性对照的值偏大。


        (2)空白对照最好做一排孔(8个或12个)。


        (3)底物缓冲液要现用现配。

        (责任编辑:大汉昆仑王)

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