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        SDS-PAGE,蛋白转印,western Blot试剂配制

        互联网

        14604

        1.5 mol/L Tris (PH8.8)

        1.称量181.7g Tris置于1L烧杯中。

        2.加入约800 ml去离子水,充分搅拌溶解。

        3.用浓盐酸调节pH值至8.8。

        4.定容至1L.

        5.高压灭菌后,室温保存

        注意:应使溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温度每升高1oC,溶液的pH值大约降低0.03个单位。
        (参照kara公司Catalog-N1)

        1 mol/L Tris (PH6.8)

        1.称量121.1g Tris置于1L烧杯中。

        2.加入约800 ml去离子水,充分搅拌溶解。

        3.按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。

        pH值 浓HCl
        6.8
        7.4 约70 ml
        7.6 约60 ml
        8.0 约42 ml

        4.定容至1L.

        5.高压灭菌后,室温保存。

        注意:1.溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温度每升高1oC,溶液的pH值大约降低0.03个单位。2. 如1 mol/L溶液呈现黄色,应予丢弃,并置备质量更好的Tris。
        (参照kara公司Catalog-N1)

        30%丙稀酰胺(100ml)

        1.称量下列试剂置于烧杯中。
        丙烯酰胺(Acrylamide) 29 g
        双丙烯酰胺 (BIS) 1 g

        2.加入约60 ml去离子水,充分搅拌溶解。

        3.定容至100 ml, 用0.45 µm滤膜滤去杂质。

        4.于棕色瓶中4 oC保存。
        注意:1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性,并可通过皮肤吸收,其作用具有积累性,配制时应戴手套等。聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为有可能含有少量的未聚合成分。

        (参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924)

        30% SDS

        1.称量10 g 高纯度(电泳级)的SDS置于100~200 ml烧杯中。

        2.加入约800 ml去离子水,68oC加热溶解。

        3.滴加数滴浓盐酸调节pH值至7.2。

        4.定容至100 ml,室温保存。

        (参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924)


        10% 过硫酸铵
        1.称量1 g过硫酸铵。
        2.加入约10 ml去离子水后搅拌溶解。
        3.储存于4oC。
        注意:10%过硫酸铵溶液在4oC保存时可使用两周左右,超过期限会失去催化作用。
        (参照Takara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924)


        1×SDS凝胶加样缓冲液
        50 mmol/L Tris•Cl (pH 6.8)
        100 mmol/L DTT
        2% SDS (电泳级)
        0.1% 溴酚蓝
        10% 甘油
        不含DTT的1×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温,临用前必须从1 mol/L DTT储存液中现用现加于上述缓冲液中。
        (参照《分子克隆》二版P884)
        本人将参照此配方,配成5×或6×,各成分浓度均扩大5倍。

        另:Takara公司Catalog-N5上的5×SDS-PAGE Loading Buffer配方:
        组分浓度:
        250 mmol/L Tris•Cl (pH 6.8)
        10% (W/V) SDS (电泳级)
        0.5% (W/V) 溴酚蓝(BPB)
        50% (V/V) 甘油
        5% (W/V) β-巯基乙醇(2-ME)
        配制量 5 ml
        配制方法
        1.称量下列试剂置于10ml 塑料离心管中。
        1 M Tris•Cl (pH 6.8) 1.25 ml
        SDS (电泳级) 0.5 g
        溴酚蓝(BPB) 25 mg
        甘油 2.5 ml
        2.加去离子水溶解后定容至5 ml。
        3.小份(500 ul/份)分装后于室温保存。
        4.使用前将25 ul的2-ME加到每小份中。
        5.加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。


        1 mol/L DTT (20 ml)
        1.称取3.09 g DTT,加入到50 ml塑料离心管中。
        2.加20 ml的0.01 M NaOAc (pH5.2),溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌。
        3.分装后-20oC保存。
        (参照《分子克隆》二版P884)


        3 M 醋酸钠(NaOAc)(100 ml)
        1.称取40.8 g NaOAc•3H2O置于100~200ml烧杯中,加入约40ml的去离子水后搅拌溶解。
        2.加冰醋酸调节pH值至5.2。
        3.定容至100 ml,高压灭菌后室温保存。
        (参照《分子克隆》二版P884)
        0.01 M NaOAc (pH5.2) 参照此配方配制。

        5×Tris-Glycine Buffer(SDS-PAGE电泳缓冲液)
        组分浓度:0.125 M Tris, 1.25 M Glycine, 0.5%(W/V) SDS
        1.称量下列试剂置于烧杯中。
        Tris 15.1 g
        Glycine 94 g
        10%(W/V) SDS(电泳级) 50 ml
        2.加入约900 ml去离子水搅拌溶解。
        3.定容至1L,室温保存。
        (参照《分子克隆》二版P884)


        Transfer Buffer:
        [自配] Transfer Buffer:500ml
        25mM Tris base, 0.2M glycine(甘氨酸), 20% methanol(甲醇PH8.5)
        先配制1M Tris base (MW:121.1) 100ml: 12.1g Tris base + ddH2O至100ml,PH约11
        1M 12.5ml Tris base + 7.5g glycine(MW:75.05) +100ml methanol  + ddH2O 至400ml,调好PH值,再加ddH2O至500ml.  
        先置于4oC保存备用。
        (参照吴兴军给Protoco, 据说优于《分子克隆》配方)


        丽春红S储存液(10×)
        丽春红S 2 g
        三氯乙酸 30 g
        磺基水杨酸 30 g
        加水至100 ml。 
        用1份上述储存液加9份去离子水即成丽春红S使用液,使用后应予废弃。

        10X TBS (Tris-buffered saline):
        To prepare 1 liter of 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl; adjust pH to 7.6 with HCl (use at 1X).
        (参照Cell signal Technology Protoco)


        Wash Buffer TBS/T:
        1X TBS, 0.1% Tween-20
        [自配] Wash Buffer TBS/T:1000ml
        1×TBS,0.1%Tween-20,100ml 10×TBS+ 1ml Tween-20  + 900ml ddH2O
        (参照Cell signal Technology Protoco)


        Blocking Buffer:
        1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% w/v nonfat dry milk。
        [自配] Blocking buffer:150ml
        for 150ml, add 15ml 10×TBS to 135 ml water,mix.Add 7.5g nonfat milk and mix well.While strirring,add 0.15ml Tween-20(100%).
        (现用现配,4oC储存备用)
        (参照Cell signal Technology Protoco)


        Primary Antibody Dilution Buffer:
        1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% blocking agent;
        for 20 ml, add 2 ml 10X TBS to 18 ml water, mix. Add 1.0 g BSA and mix well. While stirring, add 20 µl Tween-20 (100%).
        (参照Cell signal Technology Protoco)

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