E花环形成试验

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实验目的

1.掌握T淋巴细胞E花环试验的原理、正常值，了解其方法和用途。

2.熟悉光镜下E花环的形态和计数方法。

实验原理

T细胞表面具有能与绵羊红细胞（SRBC）表面糖肽结合的受体，称为E受体（CD2）。已证实E受体是人类T细胞所特有的表面标志。当T细胞与SRBC混合后，SRBC便粘附于T细胞表面，呈现花环状。通过花环形成检查T细胞的方法，称为E花环形成试验。根据花环形成的多少，可测知T细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫 功能状态，判断疾病的预后，考核药物疗效等。

实验材料

1.肝素抗凝静脉血、Hanks液、小牛血清、淋巴细胞分离液、1%绵羊红细胞悬液、0.8%
戊二醛、瑞氏染液

2.吸管、毛细滴管、玻片、试管、水平离心机 、显微镜

实验方法

（一）淋巴细胞的分离

1.取2～3ml肝素抗凝静脉血（加肝素200U/ml抗凝），用Hanks液稀释1倍，混匀。

2.取2～3ml淋巴细胞分离液加入15mm×150mm试管中。

3.用毛细滴管吸取稀释血液，在距分离液面上1cm处，沿管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液上（尽量避免冲入分层液中）。稀释血液与分层液体积比为2∶1。

1.2000转/分，水平离心20分钟，小心取出试管。

2.用毛细吸管轻轻插到血浆与分离液的界面层，沿试管壁周缘吸出富含淋巴细胞的灰白色层即单个核细胞层，移入另一试管中。

3.加入5倍以上体积的Hanks液混匀，离心1500转/分，10分钟，弃上清液，将沉淀细胞振摇重悬后加Hanks液同法洗涤2次。

4.最后用营养液配制成1～2×106/ml细胞悬液。

（二） E花环形成试验

1． 取上述淋巴细胞悬液加入等量1%绵羊红细胞悬液、0.1ml小牛血清，混匀。

37℃水浴5分钟，500转/分，离心5分钟，放4℃冰箱20分钟。

2． 弃去适量上清，轻轻摇匀，加0.8%戊二醛1滴，混匀后置4℃冰箱15分钟。

3． 取出后轻轻混匀涂片，自然干燥。

4． 瑞氏染色，将瑞氏染液加于玻片上先染1分钟，再滴以等量的蒸馏水，轻轻晃动混匀，继续染5分钟水洗，干后镜检。

结果观察

油镜检查：淋巴细胞呈蓝色，SRBC呈红色围绕淋巴细胞形成花环，凡表面粘附有3个或3个以上SRBC者为花环形成细胞（即E阳性细胞）。

计数200个淋巴细胞，算出花环形成百分率，并推测其T淋巴细胞百分率。正常值为：50～80%。

注意事项

1． 向分离液管加血液时应沿试管壁缓缓加入，使血液与分离液形成明显的界面，小心放取试管，避免打乱界面，影响分离效果。
计数及摇匀细胞时动作应轻柔，避免打散已形成的花环