细胞培养的一般技术

促细胞分裂剂激活单核细胞

基本原理 ：

本方法是通过促细胞分裂剂与细胞表面受体相互作用，在体外触发细胞的多克隆激活。根据所使用的促细胞分裂剂的不同，应答细胞可以是T淋巴细胞、B淋巴细胞，或两者同时，或者是单核细胞。 细胞激活可以通过细胞增殖、细胞因子分泌、表面抗原表达和/或细胞体积的增加进行检测。例如在使用B细胞激活剂时，可以通过多克隆免疫球蛋白的分泌进行检测。

表1 常用的促细胞分裂剂和多克隆淋巴细胞激活剂

促细胞分裂剂 所 用 浓 度 应 答 细 胞

刀豆蛋白AConA 1- 10 μg/ml T 淋巴细胞

植物凝集素PHA 1-5 μg/ml T 淋巴细胞

佛波醇酯PMA 1-10 ng/ml T 淋巴细胞

娄诺霉素+PMA 100-500 ng/ml T 淋巴细胞

脂多糖LPS 2-25 μg/ml 鼠B细胞（T不依赖型），单核细胞

美洲商陆PWN 试验测定 人B细胞（T依赖型）

葡萄球菌A，SAC 1/1000-1/10000 人B细胞

试剂和设备：

细胞悬浮液；

96孔平底组织培养板；

含血清培养基（通常为 RPMI 1640,含10% 胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素）；

促细胞分裂剂（见表1），要求纯品或半纯品，有市售商品；

多通道移液器和微量移液器；

带570nm滤片的酶标仪；

超净工作台；

CO2孵箱；

冷冻离心机。

操作步骤：

（一）促细胞分裂剂制备

根据说明书将促细胞分裂剂重新溶解于水或培养液中，制成储存液（如100´），保存于-20℃。

（二）促细胞分裂剂滴定

1、在培养液中稀释储存液到所需的第一个浓度，通常为理论最佳浓度的10倍；

2、在培养板或试管中直接将促细胞分裂剂进行浓度递减系列稀释（100 μl/孔）；

3、每孔平行重复三次；

（三）细胞激活

1、分离外周血单核细胞；

2、室温下用培养液300´ g离心10分钟，收集并洗涤细胞；

3、计数细胞并将细胞在培养液中重新悬浮至106细胞/ml，在培养板中每孔加入100μl；

4、在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育（细胞增殖需2-3天；细胞因子测定测定6小时-2天；免疫球蛋白分泌测定需5-10天）；

（四）细胞激活定量测定方法

1、细胞增殖检测方法采用MTT测定法；

2、细胞因子分泌测定或使用市售商业化试剂盒；

3、免疫球蛋白分泌测定采用ELISA检测

对照试验：

1、阴性对照：不含促细胞分裂剂的培养液为对照组；

2、促细胞分裂剂没有阳性对照。通常利用滴定曲线进行预试验确定促细胞分裂剂的最佳浓度以及最佳培养时间。

实验要点及说明：

1、促细胞分裂剂的计量应答曲线通常为钟形，并且高浓度的促细胞分裂剂其效果较差；

2、尽量避免细胞浓度过低，不要采用圆底培养板；

3、抗CD3和抗TCR抗体可以用于T淋巴细胞激活；

4、偶联到小珠上的抗免疫球蛋白抗体可以用于B淋巴细胞激活。

第一节 细胞冷冻和复苏

基本原理：

在长期的细胞培养过程中可能会出现微生物污染或基因型改变等情况，会导致具有优良特性细胞系的丢失。为防止这些细胞的丢失，细胞可以经快速冷冻并几乎无限期保存在非常低的温度下，如液氮（-176℃）。

试剂和设备：

冷冻液: 90%灭活血清+10%DMSO（或甘油），用0.45μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存；

培养液；

台盼蓝溶液（0.4%溶解于PBS）；

70%乙醇；

组织培养瓶；

15-50 ml 无菌圆锥底离心试管；

离心机；

血球计数板；

超净工作台；

光学显微镜；

37℃水浴；

冷冻管；

-80℃冰箱；

液氮和液氮容器。

操作步骤：

（一）冷冻细胞

1、收集对数生长期细胞；

2、以25μl台盼蓝溶液稀释25μl细胞悬液；用血球计数板计数并计算细胞存活率（至少应该在90%以上）；

3、细胞悬液在4℃ 条件下200´g离心10分钟；

4、将沉淀的细胞重新悬浮在冷冻液中（大约5´106细胞/0.5 ml 冷冻液）；

5、将细胞悬液加入到冷冻管中，每管0.5 ml；

6、将冷冻管置于-80℃冰箱中；

7、24小时后，将冷冻管移入液氮罐中；

8、在记录本或电脑中记录下每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。

（二）细胞复苏

1、将冷冻管迅速由液氮转入到37℃水浴中，冷冻管的顶部保持在水面以上以避免任何污染，不定时搅拌加速解冻；

2、当细胞完全解冻后，用含70%乙醇的纱布擦拭冷冻管消毒；

3、将解冻后细胞转移到含4℃预平衡培养液的试管中；

4、细胞悬液在4℃下200´g离心10分钟；

5、弃上清，将细胞重新悬浮在新鲜培养液中；

6、将细胞转移到细胞培养瓶，CO2孵箱中培养；

7、是用倒置显微镜检查细胞存活率以及细胞密度，如果细胞密度过高，用培养液稀释至适宜浓度。

对照试验

在冷冻细胞被移入到液氮罐中一段时间后，取出一管细胞复苏并进行培养以检测存活率。

实验要点及说明：

1、严格遵守液氮操作规则（即戴上合适的手套和护目镜），液态氮对眼睛极为有害；

2、对一瓶细胞培养液要尽可能多分装几个冷冻管；

3、延长暴露在DMSO中的时间对细胞有害，因此冷冻和解冻操作要尽可能快；

4、细胞可以暂时稳定保存在-80 ℃达数月；

5、每批次冷冻和复苏的细胞的存活率可能会不相同，为避免这个问题，每次细胞冻存最好分两批以上进行；

6、DMSO可以防止在细胞内部出现冰结晶，冻存过程需要逐步降低温度；

7、如果复苏后细胞难以恢复到良好状态，可以使用含10%鼠胚胎成纤维母细胞培养上清的培养液以促进恢复；

8、也可以用含20%热灭活胎牛血清和10%DMSO的培养液为冷冻液。

第二节 支持物培养法培养贴壁细胞

基本原理：

通过在支持物（如盖玻片）上培养贴壁细胞，可以应用抗体检测细胞表面抗原的表达或进行酶细胞化学以及免疫细胞化学检测。该方法的优点是细胞贴壁牢固，能够维持细胞生长时的状态。

试剂和设备

细胞悬浮液；

6孔平底组织培养板，或φ60 mm培养皿；

18mm x 18mm 或20mm x 20mm浸于75%乙醇中的盖玻片；

含血清培养基（通常为 RMPI 1640,含10% 小牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素）；

超净工作台；

CO2孵箱；

盖片镊；

操作步骤：

1、用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭干净，不要用纱布；

2、将盖玻片轻轻放入6孔培养板（每孔一片）或培养皿中（每个平皿可放置2-3片）；

3、在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时；

4、将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中，使盖玻片完全浸在培养液中；

5、将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时，将培养板取出，用盖片镊轻轻取出盖玻片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。

实验要点及说明

1、本方法适用于贴壁细胞培养，而不适用于悬浮细胞培养，悬浮细胞可使用滴片法；

2、所使用的盖玻片应该为优质玻璃制造，并经过铬酸洗液处理；

3、盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻；

4、如果需要更多生长状态一致的细胞，可以使用较大的培养皿，但不宜过大，以避免培养液的浪费和增加污染机率；

5、如果细胞贴壁生长能力较差，可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干。