过氧化物酶活性的测定（比色法）

过氧化物酶活性的测定（比色法）

原理

　　过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。

仪器药品

　　721型分光光度计　　　　　离心机

　　秒表 　　　　　　　　　　天平

　　研钵 　　　　　　　　　　磁力搅拌器

　　愈创木酚 　　　　　　　　30%过氧化氢

　　20mmol/L　　　　　　　　 KH2 PO4

　　100mmol/L 磷酸缓冲液，　pH6.0（见附表2）

　　反应混合液：100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50ml于烧杯中，加入愈创木酚28μl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19μl，混合均匀，保存于冰箱中。

操作步骤

　　1．称取植物材料1g，加20mmol/L KH2 PO4 5ml，于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min离心15分钟，倾出上清液保存在冷处，残渣再用5mlKH2 PO4 溶液提取一次，合并两次上清液，贮于冷处备用。

　　2．取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3ml，KH2 PO4 1ml，作为校零对照，另1只中加入反应混合液3ml，上述酶液1ml（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量吸光度值，每隔1分钟读数一次，读数于波长470nm下进行。

　　3．以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以△ A 470/min·mg蛋白质（或鲜重g）表示之。蛋白质含量测定参阅实验56。