免疫磁珠分选后阳性细胞极少的问题

【求助】免疫磁珠分选后阳性细胞极少

参与者：fjxm81

今天第一次用MACS磁珠进行胚胎肝细胞阳性分选，我是先将细胞与兔抗鼠一抗孵育，然后再用相应磁珠（羊抗兔磁珠）进行孵育。结果得到的阳性细胞极少无比，从早上到现在饭都没有吃，结果。。。呜呜，各位高手有没有做过类似的实验，给指点一下啊！谢谢。象这样的实验，你们一般一抗会按什么浓度开始试呢？10的7次方的细胞一般是用多少μg抗体进行孵育？

参与者：fjxm81

怎么没有人理我啊。高手帮帮忙呢！谢谢！！

参与者：wxlcmu

胚胎肝细胞没有分过，我们用免疫磁珠分离IFN阳性细胞的时候，10e7及以下的细胞抗体的用量是试剂盒的推荐用量，为20微升。有一个方法可以相对的提高筛选出的阳性细胞的量，你在细胞过柱之前，在柱的底部安一个G25的针头，由于针头比较细，所以液体流下的速度会降低，因而磁珠标记的细胞经过柱的时间会延长，进而提高阳性细胞的获得率，希望这个方法对你有用。

参与者：fjxm81

非常感谢谢楼上的，下次我用这个方法试试看。最近尝试用流式试一抗的最佳浓度，然后再作磁珠分选。磁珠分选实在是耗钱啊！

参与者：医生和球

以前曾遇到跟楼主类似的问题，后来增加了孵育时间（从原来的15min增加到30min以上）和抗体的量（比说明书增加了一倍），阳性细胞明显增多。楼主就不要吝惜抗体了，做磁珠本来就是烧钱的，何必省这么点。

还有就是上柱前后，可以取少量的细胞液涂片，进行细胞计数和在荧光显微镜下观察阳性细胞数。分别对分选前后进行细胞计数，对比分选前后细胞总数，看是否大致相等，如果分选后细胞总数减少了，说明肯定是有细胞残留在分选柱内。

在荧光显微镜下分别观察阳性细胞数，可以粗略知道阳性细胞的比例（我的做法是：在荧光显微镜下拍照，取三个以上的不同视野，分别对总细胞和阳性细胞进行细胞计数，大致计算平均阳性率），这样就可以决定你分选后的阳性率是否跟预计的是否大致一致的。

如果发现分选后阳性率比分选前减低或者分选后细胞阳性率比预计的要低的多，说明肯定是标记过程或者分选过程出了问题，这时就没有必要进行流式分析了，可以节约开支。

希望对你有所帮助！

参与者：fjxm81

嗯，好的。谢谢你啊！你说的应该很实用，我现在等老鼠怀孕13.5天就开工。