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        微管蛋白的可溶性表达及纯化

        互联网

        5703

        1、将重组质粒(BL21-2ß2或Rossatta-2ß2)的表达菌37℃摇培过夜后,1:20扩配(约需1h15m);

        2、至OD600=0.5~0.7时(约1h15min~1h45min),在15-(0.5-24,0.8-12);20-(0.5-12,0.8-8);28、25-(0.8-8)进行蛋白诱导表达,具体条件根据摇床使用情况而定;

        3、对诱导后的菌液4℃,4000g,20min,彻底去上清;离心前取2ml以备用于总蛋白电泳分析S1;

        4、细菌沉淀用BindingBuffer(无尿素,20mM咪唑)悬浮,100ml用5~10ml缓冲液(约当2~5ml每克菌量),视悬浮后的菌液浓度而定;

        5、反复冻融法破碎细胞:做到14步时由于时间原因不能立即继续后面的操作,可将菌悬液放于-70℃冰箱中冷冻;也可用反复冻融的方法来破碎细胞,在-70℃冻融,在室温下溶解,反复冻融3~4次;

        6、加Lysozyme至1mg/ml(1ml加10ul),在冰上孵育30min~1h;

        7、200~300W超声破碎,2s×30次,停顿2s;若菌种较多可以增加破碎次数。注意超声破碎时间,不可太长,否则温度升高易导致蛋白变性;而时间太短则破碎不彻底,蛋白无法释放出来;

        注意:第7步可选作,若经过冻融及溶菌酶处理后的菌悬液比较澄清,则可不用超声破碎。

        8、4℃,10000rpm20~30min,取上清;将沉淀用变性的BindingBuffer(8M尿素)悬浮,然后室温摇动30min,取40ul进行电泳样制备S2;

        9、4℃,10000rpm10min,对上清再离心一次,取40ul进行电泳样制备S3;

        10、上清通过0.45um的细菌过滤器,取40ul进行电泳样制备S4;

        11、用HisTrap纯化:

        a)洗柱:用5倍柱床体积(5ml)纯水洗柱,避免产生气泡。

        b)平衡:至少5mlBindingBuffer(20mM咪唑),一般10ml,流速在1ml/min。

        c)上样:流速要慢要,控制在1ml/min,并收集流出的蛋白液,取40ul进行电泳样制备S5;

        d)重新上样:对第一次上样流出的蛋白液再进行过柱一次,取40ul进行电泳样制备S6;

        e)平衡:用10mlBindingBuffer(20mM咪唑),收集第一管及最后一管,各取40ul进行电泳样制备S7,S8。

        f)洗脱:用5mlElutionBuffer(500mM咪唑)洗脱,每1ml一管,一般第一二管中蛋白多。

        g)平衡:用5ml的BindingBuffer(20mM咪唑)平衡柱子;

        h)封闭:用20%的乙醇封闭柱子,4℃保存。

        若需进行咪唑浓度优化,则纯化步骤改为:

        10、4梯度咪唑浓度洗脱:依次用20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500mM的咪唑进行洗脱,每个浓度各用4ml,收集第2、3V;电泳分析后确定最佳的咪唑平衡及洗脱浓度。

        12、样品处理:吸取纯化后的蛋白液40ul,加入10ul的5×的上样缓冲液,100℃水浴5min,12,000rpm离心3min后取上清点样,每个加样孔15ul。

        13、80V电泳2h左右,取出胶用染色液染色4~5h(回收的染色液可过夜),用脱色液脱色3次,观察拍照。

        附:

        1、总蛋白电泳方法:700ul,12000g离心5min,弃上清,加入50霯1×蛋白上样缓冲液,充分悬浮,煮沸5min,12000g离心5min;

        2、构建好的载体在进行蛋白诱导表达前,应选取10个左右的单克隆进行蛋白诱导的小量试验,对诱导后的总蛋白进行电泳分析,选取表达量最大的克隆保存(甘油菌,-70℃冰箱);

        3、从-70℃冰箱中活化菌进行蛋白诱导表达试验时,活化好的表达菌在4℃冰箱仅可存放15天左右,最多1个月,过期后必须重新划线活化。4℃冰箱保存的宿主菌每次用过后必须用封口膜封好。

        4、SDS-PAGE分析的蛋白样:总蛋白样S1,沉淀中的蛋白样S2,离心后上清中的蛋白样S3,过细菌过滤器后的蛋白样S4,第一次上柱时流出的蛋白样S5,第二次上柱时流出的蛋白样S6,20mMBingdingbuffer过柱后的第一管S7和最后一管蛋白样S8。

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