细胞单克隆的分离方法

一、有限稀释法

材料：

a、96孔细胞培养板等；

b、HT培养基；

c、活力强的杂交瘤细胞；

d、小鼠腹腔细胞。

方法：

a、制备小鼠腹腔细胞。同“细胞融合”一节中的方法。

b、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15和50个细胞三种不同的稀释度。

c、按每毫升加入5×104-1×105细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。

d、每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。

e、37℃、7.5% CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。

f、取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。

g、本法中（b）、（c）、（d）也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确地进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞，按每孔接种0.1ml细胞悬液，即每孔含1个细胞。

二、软琼脂法

材料：

a、HT培养基（双倍浓度）。

b、用0.15mol/L NaCl配制的2.0%琼脂糖：称取2.0g细胞培养用琼脂糖，悬浮于100ml 0.15mol/L NaCl，121℃高压灭菌15分钟，分装10ml小瓶，冷却后4℃保存。

c、小鼠腹腔细胞。

d、灭菌平皿。

e、45℃水浴。

f、活力很好的杂交瘤细胞。

方法：

a、在培养皿中制备饲养细胞（小鼠腹腔细胞）单层。

b、临用前将2.0%琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀，配成1%琼脂糖培养液，45℃水浴中温育。

c、吸去平皿上层培养液，加入1%琼脂糖培养液3ml，室温10分钟。

d、取杂交瘤细胞悬液1ml，加入1%琼脂糖培养液1ml混匀，铺于上层。

e、37℃、7.5%湿润培养7-14天；克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养。

f、吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。