正常动物肺肥大细胞的培养

实验材料：

1. 正常动物的肺组织；

2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2；

3. TE液：Tyrode液加入2 mmol/L EDTA。Tyrode液含137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、0.36 mmol/L NaH2PO4 、5.55 mmol/L 葡萄糖；

4. TEA液：TE液加入200mg/L氨苄青霉素、200mg/L庆大霉素和40mg/L甲硝唑；

5. TGMD液：Tyrode液加入0.1%明胶、1.23 mmol/L MgCl2 和15mg/L DNA酶；

6. HA液：HEPES液补充0.25g/L不含脂肪酸的BSA。HEPES液含20 mmol/L HEPES、125 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl和0.5 mmol/L 葡萄糖；

7. HACM液HA液补充1 mmol/L CaCl2 和1 mmol/L MgCl2 ；

8. 消化液a：用TE液配成，含有3g/L链霉蛋白酶和0.75g/L木瓜凝乳蛋白酶；

9. 消化液b：用TGMD液配成，含有1.5g/L胶原酶和0.15g/L弹性蛋白酶；

10. Percoll溶液：配成密度为1.090 g/ml、1.080 g/ml、1.070 g/ml和1.062 g/ml的4种溶液；

11. 培养液：ROMI1640，添加10%FBS、50μg/L SCF、2 mmol/L 谷氨酰胺、0.1 mmol/L 非必需氨基酸、100000 IU/L青霉素和100mg/L庆大霉素。pH7.2；

12. 手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪，眼科镊，止血钳，无菌消毒手术器械；

13. 离心管（15ml、50ml）

14. 网筛：300μm不锈钢网筛

实验方法：

1. 取肺组织10—40g，放入4℃的TEA液中，剥除支气管和血管后，将肺组织切成0.2—1g的小块，用TEA液冲洗2次；

2. 将肺组织剪碎，加入消化液a，在室温条件下消化20min。用孔径为300μm不锈钢筛网滤去已脱落下来的细胞。用TE液清洗组织块，加入消化液a，将组织块重复消化和过滤1次；

3. 用TGMD液清洗组织块后，加入消化液b，在30℃条件下消化20min。用孔径为300μm不锈钢筛网滤出组织块，收集滤液，在4℃条件下离心（400g，10min）。吸去上清液，用HA液混悬沉淀细胞，在4℃条件下保存；

4. 按操作步骤3重新操作1次，得到细胞悬液；

5. 将操作步骤3和4收集的细胞悬液混合，用孔径为100μm不锈钢筛网过滤，收集滤液，在4℃条件下离心（400g，10min）。然后，用4℃的HA液混悬沉淀细胞，再离心1次；

6. 用HACM液混悬细胞，调整细胞密度至0.5×106 —2×106 个/ml；

7. 在离心管中依次缓慢滴入密度为1.090 g/ml、1.080 g/ml、1.070 g/ml和1.062 g/ml的Percoll溶液。在1.062 g/ml的Percoll溶液中预先混入约1×107 个细胞。然后，在20℃条件下离心（500g，40min）；

8. 在密度1.070与1.080、1.080与1.090两个Percoll溶液界面处收集细胞，用HA液混悬细胞，在4℃条件下离心（400g，10min）。然后，重复离心1次。

9. 用培养液混悬沉淀细胞，调整细胞密度至0.5×106 —2×106 个/ml，放37℃、5%CO2的培养箱中培养。24h后换液，以后每周换液1次；