常用细胞凋亡检测方法

一、TUNEL法

细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL).

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3'-OH形成,很少能够被染色.

TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用.

二、Caspase-3活性的检测

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用,其中caspase-3为关键的执行分子,它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能.Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡.但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,caspase-3的活性明显下降.

1 Western blot 分析Procaspase-3的活化,以及活化的Caspase-3及对底物多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]等的裂解.

方法:

收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭,室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T(含0.05% Tween 20的TBS)洗3次,5~10min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次, 5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色.

2 荧光分光光度计分析

原理:活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物,水解D4-X肽键.根据这一特点,设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC.在共价偶联时,AMC不能被激发荧光,短肽被水解后释放出AMC,自由的AMC才能被激发发射荧光.根据释放的AMC荧光强度的大小,可以测定caspase-3的活性,从而反映Caspase-3被活化的程度.

方法:收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?制备细胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC(caspase-3四肽荧光底物)?37°C反应1h?荧光分光光度计(Polarstar)分析荧光强度(激发光波长380nm,发射光波长为430-460nm).

3 流式细胞术分析

方法:

收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?加Ac-DEVD-AMC?37°C反应1h?UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度.