骨、牙组织模板DNA提取――Glass milk改良法

1 主要配制试剂

1）0.5M Na2EDTA PH8.0

2) Proeinase K(20 μg/μl)

3)6M GuSCN 10ml

GuSCN 7.2g

加D·W至10ml

水浴60℃～65℃溶解

4） 二氧化硅悬浮液（Silica susponsion、用前混匀）

Silica 12g加D、W至100l
↓
充分混匀置于100ml量筒内室温沉降24小时
↓
取上层溶液85ml加D、W至100ml，置于100ml量筒内充分混匀室沉降5小时
↓
取上层溶液85ml加12μl 10M HCL、充分混匀

分装、高压灭菌（121℃ 20min）备用。

5） 70%乙醇（-20℃）

6）丙酮（-20℃）

7）Nuclease free H2O

2 主要仪器

旋转混摇器（rotator）

电泳仪

紫外分析仪

调速摇床（Rocker Platform）

Shimadzu UV-250型紫外分光光度计

3 操作步骤

3.1 样本准备

1）骨：骨高压灭菌细沙纸磨去骨表面0.5mm厚层，254nm紫外线照射1小时以防外源性DNA污染；然后用冷的去离子水、乙醇、乙醚各振摇15分钟，取出干燥。将骨片放入盛有液氮搪瓷碗内用小型手电钻钻取骨粉备用。

2）牙：254nm紫外线照射1小时，然后用冷的去离子水、乙醇、乙醚各振摇15分钟，干燥后在液氮中冷冻24小时。用高压灭菌的密度白布包裹，榔头敲击成细粉沫备用。

3.2 骨、牙组织DNA分离和纯化

1）流程图

样本 DNA提取buffer消化
↓
二氧化硅结合DNA
↓
70%乙醇、丙酮洗涤硅珠
↓
56℃洗提DNA
↓
去除二氧化硅
↓
转移DNA溶液
↓
-20℃保存备用

2）操作

①取骨粉0.25g（牙粉沫0.1g）置于1.5Eppendorf管，加1.0ml 0.5M Na2EDTA(PH8.0),25μl proteinase K(20μg/μl)。将Eppendorf管置于旋转混摇器上，室温混摇24小时。

②将样品Eppendorf管置于56℃干热器上继续消化2小时。

③离心13000rpm，5分钟。

④取上清液700μl移至另一洁净1.5ml Eppendorf管中（弃沉渣），加700μl 6M GuSCN,20⑤μl二氧化硅悬浮液置于旋转混摇器上，室温混摇2小时。

⑤离心13000rpm，20秒，充上清液保留硅珠。

⑥用-20℃ 70%乙醇洗涤硅珠两次，每次离心13000rpm,20秒。

⑦用-20℃丙酮洗涤一次，离心13000rpm,20秒。

⑧样品Eppendorpf管置于56℃干热器上，15分钟洗提DNA，每5分钟振摇一次。

⑨离心13000rpm 2分钟，将60μl DNA溶液移至0.5ml Eppendorf中，置于-20℃保存备用。

3.3 DNA定量

3.3.1 凝胶定量

1）配制1%琼脂糖凝胶：将2g琼脂糖加入200ml 1×TBE缓冲液中，煮沸溶化，待冷却至60℃加入10μlEB，充分混匀。

2）将琼脂糖溶化液灌入制胶模具，放置30分钟，使其冷却固化。

3）小心取出加样硫，将已制好凝胶放入电永槽，加1×TBE缓冲液使其高出胶面约1cm。

4）将标准含量（30μg/ml、20ng/ml、10ng/ml、50μg/ml）DNA样品，标准DNA分子量Marker和可见性DNA参照置于干热器孵育5分钟，稍离心。

5）将可见性DNA参照物及用作下量尺度的标准量DNA各10μl及待测DNA样品按从左向右依次加入胶中，两侧加标准DNA分子量Marker。

6）150v电压电泳30分钟。

7）紫外分析仪上观察结果并照像，与标准品对照推算样本DNA含量。

3.3.2 紫外分光光度计法

采用Shimadzu UV-250型紫外可见分光光度计测定DNA浓度，仪器预热10分钟，用1.0ml去离子水校正零点，吸取10μl DNA样品加990μl去离子水混匀，转入石英比色杯中。在260nm，280nm和320nm处读出光密度。

依据公式DNA样品浓度=A260×核酸稀释倍数×50‰；提取DNA溶液中蛋白含量=1.55×（A280 -A320 ）-0.76×(A260 -A320 )进行计算，核酸纯度由A260/A280的比率进行估计。

4 注意事项

1.本技术标准运用于自然条件下保存6～60年骨。

2.不同处理保存状况对骨组织DNA稳定性影响不同（如加碱水煮，火烧等），骨组织DNA骨减少。

3.本技术采用高压灭菌细砂纸磨去骨表面0.5mm厚层，254nm紫外线照射1小时消除外源性DNA污染。