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        H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法

        互联网

        6941

        (一)材料及试剂

        1.培养基 RPMI-1640或TC199培养液

        2.PHA 同形态学方法

        3.小牛血清

        4.3H-TdR 选用比活性为2Mci~10Mci/mg分子的制品,将1 Mci/ml溶液以生理盐水稀释成100µci/ml,于4℃保存备用。临用时再用培养液稀释成10µci/ml溶液。

        5.3%冰醋酸

        6.浓甲醛

        7.30%H2O2液

        8.闪烁液

        PPO(2,5二苯基噁唑) 5.00g

        POPOP[1,4-双(5-苯基噁唑基-2苯)] 0.30g

        无水乙醇 200.00ml

        甲苯 800.00ml

        混合即可

        (二)操作方法

        1.培养液中按1%的体积加双抗(含青霉素1万U/ml,链霉素0.01g/ml)及肝素液(含肝素100U/ml)。用3.5%NaHCO 3 液调pH值为7.2~7.4,然后加灭活的小牛血清,使浓度为20%。再加PHA(50U~75U/ml),无菌分装于培养瓶内,每瓶1ml。

        2.无菌操作采血,并以肝素抗凝,同时进行白细胞计数及分类计数。

        3.取0.1ml抗凝血,加入到含1ml培养液的培养瓶中,每个血样接2~3个培养瓶。如果以血浆或分离的淋巴细胞代替全血,加入培养瓶中更好。

        4.37℃培养72h,在培养结束前16h~24h,每瓶加入3H-TdR 1µci。

        5.培养结束后,将培养物移到 离心管 内,用3%冰醋酸6ml,分两次冲洗培养瓶,并将冲洗液也装入离心瓶中,2 000r/min离心10min,去上清。沉淀再用3%冰醋酸洗涤一次,同样离心去上清。

        6.在沉淀中加30%H 2 O 2 液一滴,85℃水浴15min,待溶液呈无色时,再加甲酸0.5ml,继续加热(85℃)30min,使沉淀物完全消化溶解。

        7.将消化溶解的液体移入测样杯内,用红外灯或80℃热空气烘烤至液体体积少于0.1ml,加闪烁液5ml,用液体闪烁液计数器测其脉冲数。

        8.第5~7步骤制备闪烁液样品也可以采用滤膜法制备。即:培养结束后,将培养液移入 离心管 ,2 000r/min离心10min,弃上清,沉淀用生理盐水洗涤一次、再离心。

        将沉淀移至滤膜上(注意将沉淀全部移入),减压抽滤,并依次以10ml生理盐水、5ml 5%三氯醋酸(若有带色物质,用30%H 2 O 2 液脱色)和3ml无水乙醇抽滤。取出滤膜,60℃~80℃烘干,然后将滤膜放入装有5ml的闪烁液中(贴细胞的面朝上),用液体闪烁液计数器检测。

        (三)结果判定

        以液体闪烁计数器测定每分的脉冲数cpm。取各管测定读数的平均值,即为0.1ml血样的脉冲数。全血检测的脉冲数,再按血样淋巴 细胞计数 结果,校正成每百万淋巴细胞的脉冲数(cpm/106淋巴细胞)。

        也可以刺激指数(SI)表示试验结果。为此须在培养时,设同样数量的不加PHA的对照 培养瓶 ,试验管脉冲数与对照管脉冲数之比,即为刺激指数。

        (四)注意事项

        1.血样与培养基比例一般在1:10~1:30为宜。

        2.培养细胞时,可放入CO2培养箱中培养,也可在普通温箱进行培养,但一定要把盖子拧紧,否则结果差别较大。

        3.以SI表示结果时,一定要设置相同数量培养管的对照(即不加PHA)。而以cpm绝对值表示(cpm/106淋巴细胞)则可以不用设对照管。因为对照的cpm与本底比较接近,不同样品之间的少许差别也不易确定其意义。

        4.闪烁液的容水量很低,所以在加入闪烁液之前必须烘干。但加入一定量的醇类(如无水乙醇),则可容纳少量的处理后所残留的水分,但也仍需烘至接近干燥的程度,否则将发生浑浊而无法测定。

        据报道,如果闪烁液中加入1/3的异辛基苯氧聚乙氧乙醇(TritonX-100),其容水量可达15%,消化溶解后的样品,不必烘干,即可添加闪烁液测定。

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