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        单向免疫扩散法(Single radil immunodiffusion)—正常人群IgG正常值检

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        【原理】

        在含有特异抗体的琼脂板中打孔,并在孔中加入定量的抗原 ,当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合,既形成白色沉淀环,其直径或面积与抗原浓度呈正相关。

        同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线,即可用以定量检测未知标本的抗原浓度(mg/ml或IU/ml)。应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、

        IgA及IgM的含量及正常值。

        【材料】

        1.示教部分:

        2%离子琼脂 或生理盐水琼脂(内含2‰NaN3)

        标准马抗人IgG血清(抗体)(北京生物制品研究所 生产)

        参考蛋白工作标准(北京生物制品研究所 生产)

        pH7.2 PBS

        玻璃板或载玻片。

        打孔器(孔径3mm)及打孔模板。

        微量加样器

        湿盒(容器内加湿纱布或泡沫塑料)

        2.实验部分:

        已制备好的含有马抗人IgG抗体的1%琼脂板。

        1:50稀释的单人份待检血清标本。

        打孔器、模板、微量加样器及湿盒等。

        【方法】

        (一)标准曲线的制备:示教

        1.按照玻片的大小,以能制做1~1.5mm厚度的琼脂板的量,分装其1/2量的2%盐水琼脂。例如,用普通载玻片制做时其1%琼脂量为4ml,在分装2%盐水琼脂时既为2ml。溶化后置56~60℃水浴中平衡温度备用。

        2.稀释抗体:将标准抗人IgG抗体按其效价用pH7.2 PBS做成1倍稀释。例如,血清效价为1:140,原浓血清既应稀释为1:70。并分装试管,其分装量应与2%盐水琼脂量相等。

        3.制板:将已稀释的抗人IgG抗体于56℃水浴中预热约半分钟,再倾注于已溶化并维持56~60℃的2%盐水琼脂管中,用拇指将管口堵紧。翻转试管1~2次,将抗体与琼脂混合均匀(注意:抗体与琼脂混合时切勿产生气泡),迅速倾注于玻片上,待凝固后既制成。

        4.打孔:将琼脂板置于模板上,在同一直线上用打孔器打孔5个,孔距10mm。

        5.稀释不同浓度的参考蛋白标准(工作标准):应根据制品说明进行稀释,例如:工作标准中免疫球蛋白含量,IgG为100单位/ml,80.4微克/单位,其稀释范围为1:10、1:20、1:40、1:80及1:160。

        6.加样:将已稀释的不同浓度的工作标准顺序用微量加样器每孔加入10μl(注意:每一稀释度均应更换塑料吸头)。

        7.置湿盒中,放37℃温箱,24小时后观察结果。

        8.用量角规测量并记录沉淀环直径,然后以沉淀环直径为纵座标,不同单位/ml为横座标,绘制成标准曲线。

        在制做标准曲线时,为尽量减少误差,至少应做两份以上标准板。

        (二)正常人血清中IgG值的测定:

        1.将已制备好的抗体琼脂板置打孔模板上,每一琼脂板可打孔4个(孔径3mm,孔距10mm)。

        2.将单份正常人血清用pH7.2 PBS分别作1:50稀释。

        3.用微量加样器分别取1:50稀释的单人份血清标本10μl加入孔中,每份标本应各加两孔(每份标本均应更换塑料吸头)。

        4.作好标记置湿盒中,放37℃温箱,24小时后观察结果。

        【结果】

        测量各份标本的沉淀环直径并记录结果,然后用标准曲线测出每份标本所含IgG的单位/ml,并换算为mg/ml。

        将全班实验结果做出统计及均值,并写出较完整的实验报告。

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