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        Pyrosequencing 原理概述

        互联网

        3107

        Pyrosequencing是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量的、精确和重复性好的分析的技术。

        第一步 ――测序引物和PCR扩增的、单链的DNA模板杂交,与酶―DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)、三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)―和底物―adenosine 5´ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)孵育。

        第二步 ――四种dNTP(dATPS,dTTP,dCTP,dGTP)之一被加入反应体系,如与模扳配对(A―T,C―G),此dNTP与引物的末端形成共价键,dNTP的焦磷酸基团(PPi)释放出来。

        注意 :反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATPS)是dATP的替代物,因为DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高,且dATPS不是荧光素酶的底物。

        第三步 ――ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素(oxyluciferin)的转化,氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。

        ATP sulfurylase

        PPi+APS ―――――――――> ATP

        Luciferase,ATP

        Luciferin ―――――――――> oxyluciferin

        光信号由CCD摄像机检测并由软件pyrogram™反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。

        第四步 ――ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,淬灭光信号,并再生反应体系。

        第五步 ――然后加入下一种dNTP。

        在以上步骤循环进行中,互补DNA链合成,序列从pyrogram™的信号峰中决定。

        利用PSQ96系统进行测序分析可期望得到20-30个碱基的读序长度,但是和任何测序技术一样,最大读序长度取决于模板的二级结构、碱基组成、PCR产物质量和其他参数。

        最佳化的Pyrosequencing

        Pyrosequencing反应利用的是酶级连系统,简单且强有力,给出阳性或阴性结果,每种成份和参数已最佳化,以得到高度一致的结果,精确度为99%。

        数目

        待测序模扳制备

        通过PCR技术将待测序列扩增,其中引物之一在合成时用生物素标记。加入STREPTAVIDIN包被的磁珠于扩增的DNA中,DNA分子通过引物的生物素和STREPTAVIDIN包被的磁珠形成复合体。DNA变性后,带生物素标记引物的单链在磁场中得到纯化,然后就可用于与测序引物退火,以便进行测序反应。


        PSQ 96系统系统工作流程

        1, 基因组DNA提取

        2, 设计和合成PCR引物,其中之一标记生物素; PCR反应

        3,DNA双链的分离,含生物素的单链DNA与测序引物的退火

        4,对含生物素的单链DNA的测序/基于测序的SNP分析及等位基因频率确定

        PSQ96系统包含了进行上述工作(3-4)的仪器及配件、软件、试剂,系统的设计满足高通量、快速、精确和经济的要求。

        系统定购信息 (进行SNP analysis, allele frequency determination 和sequence analysis等工作的系统)

        System and softwares

        PSQ 96 System/SNP/AQ/SQA (220-240V) Code No: 60-0085

        SNP Reagent Kit(进行SNP分析的KIT)

        Kits contain all components needed for SNP analysis:

        ●Enzyme mixture (DNA polymerase, ATP-sulfurylase, luciferase, apyrase)

        ●Substrate mixture (luciferin, adenosine 5’ phosphosulfate)

        ●Nucleotides (dATPS, dCTP, dGTP, dTTP)

        ●Reagent cartridge

        PSQ 96 SNP Reagent Kit 5x96

        - perform up to 480 SNP analyses Code No: 40-0005

        PSQ 96 SNP Reagent Kit 1x96

        - perform up to 96 SNP analyses, includes 1 x 96-well plate. Code No: 40-0001

        SQA Reagent Kits (进行序列分析的KIT)

        Kits contain all components needed for sequence analysis, optimized to allow for the number of nucleotide dispensations required when analyzing a gene-specific sequence.

        ●Enzyme mixture (DNA polymerase, ATP-sulfurylase, luciferase, apyrase)

        ●Substrate mixture (luciferin, adenosine 5’ phosphosulfate)

        ●Nucleotides (dATPS, dCTP, dGTP, dTTP)

        PSQ 96 SQA Reagent Kit

        - perform up to 96 SQA analyses Code No: 40-0006

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