药物/毒物作用后的细胞数量测定
互联网
2633
四甲基偶氮唑盐分析是将四甲基偶氮唑盐还原成甲蜡的颜色，形成紫色，从而来测定活细胞中的酶活性，由于这些试剂能够抑制细胞的活力和生长特性，该方法常用来测量毒性蛋白以及有毒物质。
一、材料和试剂
1. MTT：四甲基偶氮噻唑蓝（Sigma）
2. DPBS缓冲液（Invitrogen）
3. 一般的化学品（Sigma）
二、步骤
1. 96孔板中，每孔种植500~10 000个细胞，每孔体积200 ul。留8个孔不种植细胞，做空白对照。
2. 37℃，5%CO2条件下孵育过夜，使细胞贴壁.
3. 每个孔中加2 ul 研究的药物（溶解于DMSO中）。放置在漩涡振荡器上，150 rpm 震荡5分钟，使得样品完全混入培养液中。
4. 37℃，5%CO2条件下孵育1-5天，使得药物/毒物发挥作用。
5. 每个96孔板准备2 ml 或者更多的MTT溶液（溶于DPBS，浓度为5 mg/ml）。MTT在溶液中不能长期稳定保存，需要现配。
6. 每孔加入20 ul MTT溶液，放置在漩涡振荡器上，150 rpm 震荡5分钟，使得MTT完全混入培养液中。
7. 37℃，5%CO2条件下孵育1~5小时，使得MTT完全被代谢。
8. 倒掉培养基（可以用滤纸吸干96孔板上的残液）
9. 用200 ul DMSO重悬甲臜（MTT的代谢产物）。放置在漩涡振荡器上，150 rpm 震荡5分钟，使得甲臜充分的溶解。
10. 560 nm 处读取光密度值，减去670 nm 的背景光密度值。光密度值的高低与细胞的数量呈正关。
