高效能、低成本、重复性高---Ⅴ型病毒检测试剂盒跨入新时期

互联网2010-12-10

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经过长达一年的研发，具有生博特色的用于“Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒”上个月成功投入应用，前期的Ⅴ型腺病毒滴度检测效果良好，在行业内同类产品中处于领先水平，市场测评反应颇佳。为响应良好的市场反馈和满足不断增长的市场需求，目前生博公司生产出大批不同实用包装的“Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒”满足不同的客户要求，欢迎有兴趣的客户采购和申请免费试用装。

传统的腺病毒滴度检测方法TCID50

实验原理

利用腺病毒可以在HEK293细胞中复制的特性，将经过梯度稀释的腺病毒感染HEK293细胞，10天后感染病毒的细胞由于腺病毒的复制而发生病变，未感染腺病毒的细胞形态保持不变。此过程需要在在光学显微镜下观察。

实验步骤

♦ 在实验前24小时，向96孔板每孔加入100 μl HEK293细胞悬液，约1x10³个细胞；

♦ 准备10个无菌的Ep管，在第一个Ep管中加入990 μl的完全培养液，其余的9个管子中各加入900 μl的完全培养液；

♦ 待测病毒液的稀释：取10 μl腺病毒原液加入990 μl 的Ep管中做1:100稀释（10^-2）；然后以此为起点，再取100 μl稀释液加入到900 μl 的Ep管中做1:10稀释(10^-3)，直至稀释到10^-14；

♦ 从孵箱中取出96孔板，在显微镜下确定每孔的细胞均生长良好。吸弃旧培养液，然后依次将10^-7至10^-14稀释的病毒液加入96孔板中，每一稀释度占用一行，每一行10孔重复，每孔加入90 μl病毒稀释液，而每一行的第11-12孔均加入90 μl不含病毒的完全培养基作为对照；

♦ 将96孔板置于置37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养。

♦ 10d后观察细胞病变现象，并对CPE孔进行计数，计算每一行的阳性率，计算病毒滴度(Spearman-Karber Method):

病毒滴度=10 (x+0. 8) (pfu/ml)

X表示：从10^-1到10^-12依次稀释度下CPE阳性率孔数的总和，

单个孔阳性记为0.1

公式使用条件：

阴性对照没有CPE和生长抑制现象；加入最小稀释浓度病毒液的孔均有CPE

举例说明：

从10^-1到10^-9每个梯度10个孔均为阳性，10^-11与10^-12分别有4个和2个孔为阳性

病毒滴度=10（9+0.4+0.2+0.8）

=1010.4(pfu/ml)

=2.5×1010(pfu/ml)

酶联免疫法腺病毒滴度的测定（生博腺病毒滴度检测试剂盒）

上海生博独立开发的腺病毒滴度检测试剂盒AdTiter，可以使您在2.5天内获得准确的腺病毒滴度（单位：IU），操作简单，即使您是初次试验者也能够准确测得病毒滴度。

实验原理

腺病毒可以感染并且在HEK293细胞中复制，5型腺病毒表达一种特殊的外壳蛋白Hexon，感染腺病毒的HEK293细胞使用甲醇固定后，再用抗Hexon的一抗孵育，一抗会与腺病毒上的Hexon蛋白结合，此时加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，待二抗与一抗结合后再加入辣根过氧化物酶的底物DAB进行染色，然后洗脱多余的染色液，被病毒感染的阳性细胞会被染成褐色，计数阳性细胞，利用公式计算病毒滴度。

实验步骤

♦ (1)选取状态良好的HEK293细胞，使用完全培养基重悬细胞，制备成2.5×105个/ml的细胞悬液，24孔板每个孔中种入1ml细胞，37℃、5%CO2培养1小时。

♦ (2)准备好10倍梯度稀释的病毒样品，每孔逐滴加入100μl病毒样品。

♦ (3) 37℃、5%CO2感染2天。

♦ (4)轻轻的去除培养液，沿着24孔板侧壁缓缓加入预冷的甲醇0.5ml，-20℃孵育20min。

♦ (5)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。

♦ (6)使用1%BSA的PBS室温封闭1小时。

♦ (7)加入0.25ml的1×anti-Hexon抗体溶液至每个孔中，室温孵育1小时。

♦ (8)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。

♦ (9)加入0.25ml1×辣根过氧化物酶标记的二抗至每孔，室温孵育1小时。

♦ (10)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。

♦ (11)加入0.25ml新配置的1×DAB工作液至每孔，室温孵育10min。