新型核酸衍生体2-Cl-C.OXT-A在血管新生中的作用

香川大学医学部 药物生物体情报学讲座 塚本郁子

前言

血管新生和在旧血管里构造新血管对在胎儿的生长、创伤治愈、肿瘤增殖及转移等各种过程中有重要作用。特别它是肿瘤生长、转移的必经阶段，一直以来不少科研人员将血管新生的抑制剂用于抗肿瘤药物的研究。至于血管新生促进剂，它主要是用于治疗血流灌注不足等诸多症状，但实际应用不多，主要是因为除了从生物体提取的增殖因子以外，科研人员很少能识别出其他有此作用的物质。血管新生治疗在血流灌注不足等方面被寄予厚望。血流灌注不足是由于糖尿病患者的慢性闭塞性动脉硬化、脉管炎病及其他动脉硬化等各种血管闭塞等引起的。但是现在进行的血管新生治疗只限于向患者注射增殖因子和进行基因治疗等方法，众人期待能研发出可以替代这些方法的稳定、便宜的低分子。本文作者及研究团队介绍新型低分子化合物2-Cl-C.OXT-A在血管新生方面的作用。

2-Cl-C.OXT-A的活性表达过程

以前此研究团队以稀少糖为中心进行单糖的生理活性研究。在各种生理活性的报告中，研究团队研究的是稀少糖对于血管内皮细胞在管腔形成过程中的影响。通过血管内皮细胞形成管腔，是生物体血管新生的模型。这个实验筛选了超过40种单糖的效果，并确定一部分的稀少糖、核糖、2-脱氧核糖对管腔形成有抑制作用。核糖、2-脱氧核糖不用细说，因为它们是生物体内核酸的组成成分。为此研究人员将研究对象扩大到单糖衍生体的核酸，核酸医药品、合成核酸和其衍生体等的活性。研究的核酸达到30多种。与预期相同，多数核酸会抑制管腔形成，但其中只有一种物质显示了强大的促进作用。那个物质就是本文要介绍的2-Cl-C.OXT-A）。

2-Cl-C.OXT-A简介

2-Cl-C.OXT-A及其类似化合物的结构式如图1所示。这是日本德岛文理大学香川药学部的丸山德见教授按照Basacchi及其研究团队的方法合成出来的。2-Cl-C.OXT-A的2位被氯取代，没有与核糖、2-脱氧核糖结合，而是结合了有两个羟甲基的丁烷环的结构。同样的丁烷环里结合了核酸碱基鸟嘌呤的C.OXT-G（此化合物被开发成抗病毒药Lobucavir），与现在经常使用的抗病毒药Ganciclovir有相似的结构。为了讨论2-Cl-C.OXT-A活性的相关活性结构，我们比较了图1里化合物的活性。

图1、2-Cl-C.OXT-A及其类似化合物的结构式

管腔形成促进与化合物构型相关

把人类脐带静脉内皮细胞（HUVEC）和人类成纤维细胞一同培养，HUVEC会形成管腔。在此基础上科研人员研究了这一系列添加剂的效果。在培养基里添加1μM、10μM、100μM等不同浓度的2-Cl-C.OXT-A，各浓度下形成的管腔如图2所示。阳性对照的VEGF（vascular endothelial growth factor A）与2-Cl-C.OXT-A促进管腔形成作用都很明显，但2-Cl-C.OXT-A作用比VEGF更强，并且这种作用呈浓度依赖性。无添加的对照里形成的管腔面积为1时，2-Cl-C.OXT-A相对值为1μM为1.36±0.40、10μM为2.44±0.89、100μM为3.78±1.09。VEGF值为1.84±0.48（各n=9、mean±SD），说明10μM 的2-Cl-C.OXT-A比VEGF有相同甚至更强的作用，而100μM的2-Cl-C.OXT-A的作用甚至是VEGF的2倍。

这种促进作用在去除了2-Cl-C.OXT-A腺嘌呤部分的碱基，（图1的C.OXT-A），腺嘌呤变成鸟嘌呤（图1的C.OXT-G）后消失。2-Cl-腺嘌呤的结构是这个生理活性所必须的。但是，只有2-Cl-腺嘌呤结构是不够的。图1所示的2-Cl-腺苷、2-Cl-2'-脱氧腺苷虽然有2-Cl-腺嘌呤结构，却没有管腔形成促进活性。证明活性表达，需要含有卤化的腺嘌呤和有两个羟甲基的丁烷环这两个条件。

2-Cl-C.OXT-A的管腔形成促进作用的最高峰值在100μM，超过了这个浓度其作用就会减弱，超过1000μM后会转为抑制作用。

图2、2-Cl-C.OXT-A促进HUVEC的管腔形成

对增殖和迁移的影响

生物体内血管新生时，血管内皮细胞形成管腔前后，会发生血管内皮细胞的迁移。例如肿瘤细胞会分泌血管新生诱发因子VEGF，再以此向附近的血管内皮细胞发出血管新生的信号，接收到信号后，血管内皮细胞会构建新的血管。利用HUVEC的增殖和迁移研究2-Cl-C.OXT-A的效果时，发现2-Cl-C.OXT-A在浓度为10-100μM条件下，会促进HUVEC的增殖和迁移。

信号转导系统的研究

生物体内血管新生的启动子（Promoter）已知有好几种，其中最强大的是VEGF。在血管必须存在的地方会分泌VEGF，并与附近的血管内皮细胞里存在的受体结合从而诱导血管新生。关于这过程中信号转导的研究报告很多，但依然有许多不明之处。研究团队使用经典的通路之一的MAP kinase cascade相关的磷酸化抗体来研究2-Cl-C.OXT-A的效果。图3所示，添加了2-Cl-C.OXT-A后10-15分钟，促进HUVEC的MAP kINASEerk1/2的磷酸化，同时下游的MAP kinasekinase MEK的磷酸化也增加。MEK inhibitor PD98059不但会抑制ERK1/2的磷酸化，还会抑制HUVEC的管腔形成。然而由于2-Cl-C.OXT-A的促进管腔形成作用，它能激活MEK相关的信号转导系统。另外，在最上游里添加VEGF受体的抑制剂SU5416，对2-Cl-C.OXT-A活化ERK1/2没有影响，因此2-Cl-C.OXT-A的作用点在其下游和MEK之间。

图3、在HUVEC中2-Cl-C.OXT-A对MEK、ERK1/2的活性化

活体内实验

用活体内实验证明2-Cl-C.OXT-A的血管新生作用，在活体内用鸡胚尿囊绒膜和兔角膜研究。

图4是用鸡胚尿囊绒膜的实验（CAM assay）结果。是在孵化第11日的胚绒尿膜里添加添加剂，放置于20μl的Matrigel里，再培养42-48小时后的胚绒尿膜样子。添加了VEGF、2-Cl-C.OXT-A的凝胶有血管新生，且能使附近的血管更加靠近，而在无添加的凝胶里没有新生血管的形成。

兔角膜的实验方法（corneal micropocket assay）是在一边眼角膜里制作的口袋，埋入含有添加剂的Φ3mm X厚度0.5mm的EVA（Ethylene vinyl acetate copolymer）薄膜，7天后再观察。并在对眼里埋入无添加的薄膜作对照。阳性对照使用bFGF（basic fibroblast growth factor）。结果按照向薄膜延伸的新生血管的总长度来评价，无添加对照长度为1.62±0.85mm、bFGF为6.96±1.18mm，然后2-Cl-C.OXT-A为5.72±0.46mm（各自n=5、mean±SE），2-Cl-C.OXT-A与bFGF阳性对照结论相同，证明2-Cl-C.OXT-A能增加血管新生。

图4、CAM（chorioallantoic membrane） assay里2-Cl-C.OXT-A的促进作用。图为在Matrigel 20μl中的添加剂。

2-Cl-C.OXT-A应用的可能性

根据以上研究，可看出2-Cl-C.OXT-A在体外实验里能促进HUVEC的管腔形成、增殖、迁移。这个作用原理与MAP kinase cascade的MEK磷酸化（活化）相关。使用鸡胚尿囊绒膜、兔角膜的体内实验也确认到其有血管新生的作用。2-Cl-C.OXT-A是分子量为284的合成低分子化合物，化学性质非常稳定，2-Cl-C.OXT-A粉末在常温下也可保存。研究人员用2mM的生理盐水溶液溶解此化合物，保存在冰箱里，使用数月此化合物正常。284的分子量在药剂学上是可经皮肤、粘膜吸收。如今为治疗疾病，有人采用注射、基因导入化学性、生物学性都不稳定的VEGF、FGF（Fibroblast growth factor）等作为血管新生促进物质，比起这些物质，可做成药膏、药贴、涂剂等的2-Cl-C.OXT-A有明显的优越性。另外，在HUVEC里确认了活化的MAP kinase cascade是在多种细胞里存在的信号转导系统。但是不仅只有血管内皮细胞里有血管新生现象，在其它细胞中也有，此外此化合物也有可能对其他细胞其他功能产生影响，因此这些对于今后2-Cl-C.OXT-A的相关研究至关重要。