DNA重组

亚硫酸氢钠处理的DNA扩增后使甲基化的胞嘧啶残基成为胸腺嘧啶，而已经甲基化的胞嘧啶残基仍维持胞嘧啶。这种变化会产生新的酶切位点或保持原有的甲基化依赖位点。PCR反应的引物中不包含CpG二核苷酸，因此与模板和原来的甲基化位点不会混淆。在此之后，将PCR产物纯化、酶切、聚丙烯酰胺凝胶电泳、电印迹、单核苷酸杂交和磷图像定量。 COBRA是一个测定DNA甲基化敏感的定量方法，在检测完全甲基化和 ...

亚硫酸氢钠处理的DNA扩增后使甲基化的胞嘧啶残基成为胸腺嘧啶，而已经甲基化的胞嘧啶残基仍维持胞嘧啶。这种变化会产生新的酶切位点或保持原有的甲基化依赖位点。PCR反应的引物中不包含CpG二核苷酸，因此与模板和原来的甲基化位点不会混淆。在此之后，将PCR产物纯化、酶切、聚丙烯酰胺凝胶电泳、电印迹、单核苷酸杂交和磷图像定量。 COBRA是一个测定DNA甲基化敏感的定量方法，在检测完全甲基化和 ...

Ms―SnuPE即甲基化特异的单核苷酸扩增，它能对不同甲基化特异位点进行快速定量，是一种快速估计特异性CpG位点甲基化不同情况的定量方法。 先用重亚硫酸盐处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。进行PCR扩增，然后取等量扩增产物置于2管中，分别作为Ms―SnuPE单核苷酸引物延伸的模板。设计用于Ms―SnuPE延伸的引物的3’端紧邻待测碱基。同时于2 ...

methylation sensitive restriction endonuclease，MSRE是一类对其识别位点含有甲基化碱基敏感的限制性内切酶，目前至少已发现320种。此类酶如在其切割位点中含有一个甲基化碱基，则它们中的绝大多数就不能切割DNA。MSRE法是基于甲基化敏感Ⅱ型限制性内切酶不能切割含有一个或多个甲基化切点序列的基本原理。用甲基敏感Ⅱ型内切酶及其同工酶(对甲基化不敏感) ...

methylation sensitive restriction endonuclease，MSRE是一类对其识别位点含有甲基化碱基敏感的限制性内切酶，目前至少已发现320种。此类酶如在其切割位点中含有一个甲基化碱基，则它们中的绝大多数就不能切割DNA。MSRE法是基于甲基化敏感Ⅱ型限制性内切酶不能切割含有一个或多个甲基化切点序列的基本原理。用甲基敏感Ⅱ型内切酶及其同工酶(对甲基化不敏感) ...

酶的区域性甲基化分析是一种定量区域性CpG甲基化密度研究方法。基因组DNA在亚硫酸氢钠处理后，感兴趣的区域由包含dam位点的引物扩增。扩增后的PCR产物与14C标记的SAM及dam甲基转移酶温育，作为标准DNA定量的内参照。之后将3H标记的SAM和M．SssI甲基转移酶温育。在每个检测中使用具有确定甲基化位点细胞系DNA的标准混合物，每个样品的3H／14C比值转化为所测序列的甲基化密度百分比。 ...

酶的区域性甲基化分析是一种定量区域性CpG甲基化密度研究方法。基因组DNA在亚硫酸氢钠处理后，感兴趣的区域由包含dam位点的引物扩增。扩增后的PCR产物与14C标记的SAM及dam甲基转移酶温育，作为标准DNA定量的内参照。之后将3H标记的SAM和M．SssI甲基转移酶温育。在每个检测中使用具有确定甲基化位点细胞系DNA的标准混合物，每个样品的3H／14C比值转化为所测序列的甲基化密度百分比。 ...

甲基化荧光检测(methylight)是利用荧光定量性PCR检测亚硫酸氢钠处理后的序列改变。在TaqManR技术中，可以使用3种不同的单核苷酸(正义引物、反义引物和荧光杂交探针)，进行不同序列的检测。与已存在的技术相比，甲基化荧光检测最明显的优点就是能同时对几百甚至几千例样品迅速检测。 高敏感、快速是本方法最显著的特点，它可以在非甲基化等位基因超出10 000倍的情况下精确地检测 ...

(version MAY-1998)I. NEBULIZATION of DNA 1. 0.5 - 5 ug DNA in TE (10mM/1mM) 25% glycerol final volume 500 ul 2. nebulize for 90-100 sec at 5-10 psi (for a medium size of about 1.5kbp) 3. P ...

(version MAY-1998)I. NEBULIZATION of DNA 1. 0.5 - 5 ug DNA in TE (10mM/1mM) 25% glycerol final volume 500 ul 2. nebulize for 90-100 sec at 5-10 psi (for a medium size of about 1.5kbp) 3. P ...

转染方法 原理主要应用特点厂家及产品DEAE－葡聚糖法带正电的DEAE-葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞 瞬时转染相对简便、重复比磷酸钙好但对细胞有一定的毒副作用转染时需除血清且一般只用于BSC-1CV-1COS细胞系Sigma-Aldrich(DEAE-Dextran Transfection Kit)磷酸钙法磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞 ...

焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并由Pyrogram ...

焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并由Pyrogram ...

DNA 甲基化是发生在DNA碱基序列上的一种共价修饰。在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在5'-CpG-3‘双核苷酸序列的胞嘧啶上。在人类基因组中，大约有60%~70%的CpG胞嘧啶是甲基化的，其程度因不同的物种和细胞类型而异。DNA甲基化状态在基因组中呈现出一定的分布模式，90%的甲基胞嘧啶位于重复序列上。CpG岛广泛分布于启动子区域以及编码基因的第一外显子区。基因组这种甲基化谱式 （methy ...

近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突瘘和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表过和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。　　医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原 ...

固定于滤膜上的RNA的预杂交、杂胶及淋洗等条件，与DNA杂交的相应条件基本相同。现简述如下1）用下列两种溶液之一进行预杂交，时间1－2小时。若于42℃进行，应采用。50％甲酰胺5xSSPE2xDenhardt试剂0.1％SDS若于68℃进行，应采用：6xSSC2xDenhardt试剂0.1％SDS 2）在预杂交液中加入变性的放射性标记探针，如欲检测低丰度mRNA， 所用探针的量至少为0.1μ ...

目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因些上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特 ...

目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因些上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特 ...

PCR amplification The PCR reaction mix (10 µL) contains template DNA (2 ng/µL) primer (0.3 µM) Taq DNA polymerase Stoffel Fragment (Perkin Elmer; 5 U) Mg++ (2.5 mM) buffer (1X) and overlaid with a dro ...

BAC DNA preparation Miniprep with AutoGen 740 Innoculate 3-4 ml LB with 20µg/ml chloramphenicol Grow at 37 °C overnight with shaking Isolate BAC DNA with AutoGen 740 Resuspend BAC DNA in 50 µl TE pH8. ...