DNA重组

A. Hybridization1. Denature probe (dig-dUTP labeled) for 5' at 90-100° C in boiling water bath. 2. At the same time prehyb blot with at least 15 ml hyb solution in a hyb tube for at least 5'. Any preh ...

A. Hybridization1. Denature probe (dig-dUTP labeled) for 5' at 90-100° C in boiling water bath. 2. At the same time prehyb blot with at least 15 ml hyb solution in a hyb tube for at least 5'. Any preh ...

Reagent Final Conc. Volume Mass Salmon Testes DNA (Sigma D-9156)10.4 mg/ml boil 5 min. before use optional: dextrane sulfate dH2O ad 20 ml (1 hour)Isolate 1-10 µg target cDNA from vector with restrict ...

Reagent Final Conc. Volume Mass Salmon Testes DNA (Sigma D-9156)10.4 mg/ml boil 5 min. before use optional: dextrane sulfate dH2O ad 20 ml (1 hour)Isolate 1-10 µg target cDNA from vector with restrict ...

细胞培养是现代生物学研究中应用最为广泛的技术之一。它的突出优点，一是研究对象是活的细胞，可长时期地监控、检测甚至定量评估其形态、结构和生命活动等；二是可以人为地严格控制研究条件，便于研究各种物理、化学、生物等外界因素对细胞生长、发育和分化等的影响，有利于单因子分析；三是研究的样本可以达到比较均一性。常用的细胞系均是性质均一的细胞，需要时还可采用克隆化等方法使细胞进一步纯化；四是研究的内容便于观察、 ...

细胞培养是现代生物学研究中应用最为广泛的技术之一。它的突出优点，一是研究对象是活的细胞，可长时期地监控、检测甚至定量评估其形态、结构和生命活动等；二是可以人为地严格控制研究条件，便于研究各种物理、化学、生物等外界因素对细胞生长、发育和分化等的影响，有利于单因子分析；三是研究的样本可以达到比较均一性。常用的细胞系均是性质均一的细胞，需要时还可采用克隆化等方法使细胞进一步纯化；四是研究的内容便于观察、 ...

前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了 很多次，不过很快改善了 实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的 选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHIHindIII提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在 ...

前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了 很多次，不过很快改善了 实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的 选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHIHindIII提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在 ...

第三部分 修饰后DNA纯化回收EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中。2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up ...

第三部分 修饰后DNA纯化回收EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中。2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up ...

CTAB 法　①取0. 2g 各中药材样品分别用液氮( Ⅰ) 、玻璃砂( Ⅱ) 、氧化铝( Ⅲ) 研磨。②加入56 ℃ 10 倍预热的缓冲液C 于56 ℃温育30 min 离心 取上清液加入等体积氯仿- 异戊醇(24∶1) 抽提(室温 不能低于15 ℃ 否则CTAB 会沉淀) 10 000g 离心15 min。③取上清液加入1/ 10 倍体积缓冲液D 于室温下放置15 min 再用等体积氯 ...

CTAB 法　①取0. 2g 各中药材样品分别用液氮( Ⅰ) 、玻璃砂( Ⅱ) 、氧化铝( Ⅲ) 研磨。②加入56 ℃ 10 倍预热的缓冲液C 于56 ℃温育30 min 离心 取上清液加入等体积氯仿- 异戊醇(24∶1) 抽提(室温 不能低于15 ℃ 否则CTAB 会沉淀) 10 000g 离心15 min。③取上清液加入1/ 10 倍体积缓冲液D 于室温下放置15 min 再用等体积氯 ...

近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突变和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表达和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。　　医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原 ...

近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突变和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表达和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。　　医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原 ...

一、概述　　前面已经介绍了核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行。由于DNA一般都以双链形式存在 ...

一、概述　　前面已经介绍了核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行。由于DNA一般都以双链形式存在 ...

四、核酸探针的标记和检测　　分子杂交是核酸链间碱基配对规则的一种结合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子杂交这一特性来对特定核酸序列进行检测，必须将杂交链中的一条用某种可以检测的分子进行标记，这条链就称为核酸探针。因此，核酸探针的制备是分子杂交技术的关键。最早采用的也是目前最常用的核酸探针标记方法是放射性同位素标记。常用的放射性同位素有32P和35S前者能量高，信号强，最常用。放射性同位素标记探针 ...

五、核酸分子杂交的类型　　随着基因工程研究技术的迅猛发展，新的核酸分子杂交类型和方法在不断涌现和完善。核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。　　由于固相杂交后，未杂交的游离片段可容易地漂洗除 ...

五、核酸分子杂交的类型　　随着基因工程研究技术的迅猛发展，新的核酸分子杂交类型和方法在不断涌现和完善。核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。　　由于固相杂交后，未杂交的游离片段可容易地漂洗除 ...

六、核酸分子杂交实验因素的优化　　（一）探针的选择　　根据不同的杂交实验要求，应选择不同的核酸探针。在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。例如，在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针（通过克隆人M13噬菌体DNA获得）或RNA探针，寡核苷酸探针也可。长的 ...